2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)生菌膜結(jié)合葡萄糖酸脫氫酶的分離純化及性質(zhì).pdf

1、2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是目前大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的有機(jī)酸之一，具有廣泛的工業(yè)用途，主要用作食品添加劑D-異抗壞血酸及其鈉鹽的合成前體。膜結(jié)合的葡萄糖酸脫氫酶(gluconate dehydrogenase，GADH，EC1.1.99.3)是葡萄糖代謝特別是2KGA生物合成過(guò)程中非常重要的氧化還原酶之一，可特異性地催化底物D-葡萄糖酸為2KGA。
　　本論文對(duì)國(guó)內(nèi)2KGA工業(yè)生產(chǎn)用

2、菌熒光假單胞菌AR4的GADH進(jìn)行了分離純化和鑒定，系統(tǒng)研究了GADH的酶學(xué)性質(zhì)，初步開(kāi)展了酶促反應(yīng)和抑制作用動(dòng)力學(xué)的研究，為后續(xù)的GADH的過(guò)量表達(dá)研究乃至2KGA高效生產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供一定的理論依據(jù)。
　　主要結(jié)論如下:
　　(1)經(jīng)過(guò)超聲波破碎細(xì)胞、Triton X-114兩相分離、硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析以及Hydroxyapatite Fast Flow吸附層析等步

3、驟分離純化，獲得了比活為69.8 U/mg、純化倍數(shù)達(dá)116.3倍的熒光假單胞菌AR4的GADH。
　　(2) SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，熒光假單胞菌AR4的GADH具有3個(gè)亞基，相對(duì)分子質(zhì)量分別為27.0、45.0和66.0 kDa左右?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析結(jié)果證明，從熒光假單胞菌AR4分離純化的蛋白質(zhì)確實(shí)為膜結(jié)合的FAD依賴(lài)的GADH，其3個(gè)亞基分別為脫氫酶亞基、細(xì)胞色素c亞基和功能未知的小亞基。

4、>　　(3)酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，熒光假單胞菌AR4的GADH的最適反應(yīng)pH值為6.0，最適反應(yīng)溫度為30℃，在pH4.0～7.0和30℃下都具有較好的穩(wěn)定性;Mg2+和Mn2+對(duì)GADH具有促進(jìn)作用，而Cu2+、Zn2+、Fe3+、一些常用的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、正己烷、丙酮和異戊醇）、丙酮酸鈉、2KGA的鈣鹽和β-巰基乙醇等對(duì)該酶具有不同程度的抑制作用;EDTA對(duì)GADH幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明其不屬于金屬離子依賴(lài)性酶;GADH對(duì)D-葡萄