應(yīng)用熒光標(biāo)記多重PCR對(duì)散發(fā)性結(jié)直腸癌進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè).pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一。結(jié)直腸癌(Colorectalcarcinoma，CRC)從發(fā)生機(jī)制上可分為兩種不同的類型：染色體不穩(wěn)定和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstability，MSI)。MSI腫瘤的發(fā)生原因是DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair，MMR)功能障礙，在復(fù)制重復(fù)DNA序列時(shí)常出現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)失敗。顯然在DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷的結(jié)直腸腫瘤中，微衛(wèi)星改變是一個(gè)重要的分子表型特征。MSI最

2、初在家族性非息肉性結(jié)直腸癌(HNPCC)腫瘤中得到確定，其原因是錯(cuò)配修復(fù)基因的突變。典型的HNPCC患者90％以上為MSI瘤。也有15％左右的散發(fā)性結(jié)直腸癌存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定。 微衛(wèi)星是重復(fù)單位為1-6bp的重復(fù)序列，數(shù)十萬(wàn)個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遍及整個(gè)基因組。微衛(wèi)星是遺傳學(xué)圖譜制作、法醫(yī)個(gè)體鑒定、移植相容性檢測(cè)等的重要標(biāo)記。MSI是指由于缺失或插入重復(fù)單位引起腫瘤DNA與同一個(gè)體的正常胚系DNA相比微衛(wèi)星長(zhǎng)度發(fā)生改變，即產(chǎn)生異常長(zhǎng)度的等位

3、基因。MSI作為MMR缺陷的指標(biāo)，是由復(fù)制錯(cuò)誤引起，相對(duì)于胚系長(zhǎng)度而言微衛(wèi)星片段長(zhǎng)度發(fā)生了縮短或延長(zhǎng)。MSI的HNPCC發(fā)生的主要原因是生殖細(xì)胞的MMR基因突變。hMLH1,hMSH2，hMSH6和bPMS2等任何一個(gè)或幾個(gè)MMR基因的失活都能導(dǎo)致MSI發(fā)生。散發(fā)結(jié)直腸癌病人多數(shù)僅有MMR基因體細(xì)胞突變?，F(xiàn)在認(rèn)為MSI的發(fā)生除了生殖細(xì)胞MMR基因的突變途徑以外，還與啟動(dòng)子甲基化引起hMLH1表達(dá)缺失有關(guān)。 在散發(fā)性結(jié)直腸癌中hM

4、LH1啟動(dòng)子甲基化是MSI的重要機(jī)制。但在散發(fā)性結(jié)直腸癌中MSI的發(fā)生機(jī)制還未被完全闡明，相關(guān)的基因、路徑等也可能與HNPCC不同。由于HNPCC和散發(fā)性結(jié)直腸癌的MSI發(fā)生機(jī)制上的差異，兩者的臨床意義也不同。MSI表型可分為兩類：高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-high，MSI-H)和低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-low，MSI-L)。 在散發(fā)性結(jié)直腸癌或在HNPCC中都能出現(xiàn)MSI-H。MSI-H的散發(fā)性結(jié)直腸癌大多數(shù)與表遺傳學(xué)因素引

5、起的MMR基因MLH1失活有關(guān)。與MSI-H腫瘤不同，MSI-L腫瘤與微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellitestability，MSS)腫瘤相似，也通常是經(jīng)染色體不穩(wěn)定途徑發(fā)生的。因此提示MSI-L腫瘤與MSS腫瘤只是在微衛(wèi)星改變數(shù)量上不同，但沒(méi)有本質(zhì)上的差異。 將來(lái)研究的一個(gè)方向是在非MSI-H腫瘤中評(píng)價(jià)特異性突變，力圖尋找并識(shí)別MSI-L腫瘤和MSS腫瘤的細(xì)微差異。MSI狀態(tài)可用于預(yù)測(cè)預(yù)后和指導(dǎo)治療方案制定。抑癌基因失活引

6、起的雜合性丟失(thelossofheterozygosity，LOH)是CRC發(fā)生的另一個(gè)重要過(guò)程。缺失突變或染色體丟失都可引起某一位點(diǎn)丟失一個(gè)等位基因而發(fā)生LOH。LOH作為另一個(gè)常見的微衛(wèi)星改變的表型，在CRC發(fā)生中具有重要意義，分析LOH是一種發(fā)現(xiàn)候選抑癌基因的有效途徑。 為了識(shí)別CRC典型的遺傳改變和尋找有用的標(biāo)記物，我們對(duì)2007-2008年間的63例散發(fā)性結(jié)直腸癌與配對(duì)的正常粘膜上皮樣本進(jìn)行了研究。通過(guò)評(píng)價(jià)CRC患

7、者的MSI頻率和LOH情況，研究它們?cè)谏l(fā)性結(jié)直腸癌中的作用。文獻(xiàn)報(bào)道采用不同類型和不同數(shù)量的標(biāo)記檢測(cè)同一種腫瘤，得到的微衛(wèi)星頻率結(jié)果可截然不同，這很可能與所選標(biāo)記及檢測(cè)方法的敏感度差異有關(guān)。 為了使微衛(wèi)星分析標(biāo)準(zhǔn)化，1997年美國(guó)國(guó)家癌癥學(xué)會(huì)會(huì)議推薦了5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記用于檢測(cè)MSI，以及根據(jù)檢測(cè)結(jié)果制定MSI分級(jí)指導(dǎo)方案。我們用多重?zé)晒釶CR結(jié)合ABI3130遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophores

8、is，CE)，檢測(cè)并分析所推薦的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)：BAT25，BAT26，D2S123，D5S346和D17S250。我們檢測(cè)了63例腫瘤的MSI情況并研究MSI和MSS病人的部分臨床病理指標(biāo)。2/5及以上的位點(diǎn)出現(xiàn)不穩(wěn)定判為MSI-H。所有位點(diǎn)都穩(wěn)定的為MSS。在這個(gè)研究中我們還分析了散發(fā)性結(jié)直腸癌5個(gè)位點(diǎn)的LOH情況。 我們建立并優(yōu)化了一套通過(guò)檢測(cè)若干位點(diǎn)MSI情況的臨床分子診斷方法。正常胚系和腫瘤樣本經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，PCR

9、產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳過(guò)程中依據(jù)大小不同被區(qū)分開，并識(shí)別腫瘤組織中長(zhǎng)度異常的等位基因。 這種基于多重PCR模式的檢測(cè)方法優(yōu)于以往的聚丙烯酰胺凝膠電泳、放射自顯影等。CE是一種先進(jìn)的熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析工具。 這種方法最初用于法醫(yī)鑒定，然而現(xiàn)在由于它敏感和相對(duì)快速的優(yōu)點(diǎn)在臨床檢驗(yàn)工作中被日益重視。但由于多重?zé)晒釶CR-CE是一項(xiàng)精度要求相對(duì)較高的檢測(cè)技術(shù)，因此實(shí)驗(yàn)操作中不少細(xì)節(jié)是影響檢測(cè)成敗的關(guān)鍵因素，并可能引起微衛(wèi)星數(shù)據(jù)

10、分析的錯(cuò)誤解釋。在研究過(guò)程中我們分析并找到了這些常見問(wèn)題的解決方法，對(duì)該技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化。 同時(shí)我們改良了從福爾馬林固定組織中抽提DNA的方法，用于已知臨床診斷的檔案樣本的MSI分析。而較久一些的樣本因?yàn)榻Y(jié)合臨床跟蹤隨訪而具有更高的價(jià)值。我們用這個(gè)方法抽提的DNA能用于多種分子研究，包括PCR反應(yīng)、片段分析和直接測(cè)序等。由于DNA化學(xué)修飾以及隨著時(shí)間的遷移而發(fā)生持續(xù)的降解等原因，從福爾馬林固定組織中抽提質(zhì)量高的DNA是比較困難

11、的。 福爾馬林固定液加入組織后能使脂質(zhì)分離、蛋白質(zhì)變性以及細(xì)胞膜、染色體和DNA的脆性度大大增加。我們將改良法和常規(guī)酚-氯仿-異戊醇法抽提的DNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行了比較。改良方法抽提DNA在數(shù)量上與常規(guī)法相似，但在DNA的質(zhì)量和抽提成功率上明顯優(yōu)于常規(guī)法。用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)改良法抽提的DNA質(zhì)量，得到的DNA片段大小都在500bp以上，大部分在1000bp以上。 用5個(gè)MSI敏感標(biāo)記分析散發(fā)性結(jié)直腸癌的MSI及LOH情

12、況時(shí)，我們得到MSI總的檢出率為34.92％(22/63)，其中MSI-H16例(25.4％)，MSI-L6例(9.52％)，MSS41例(65.08％)。這些結(jié)果顯示MSI在散發(fā)性結(jié)直腸癌中可能是常見的事件。 微衛(wèi)星各位點(diǎn)突變率分別是D5S346(14.29％)，BAT26(9.52％)，BAT25(22.22％)，D17S250(23.81％)，D2S123(25.4％)。MSI腫瘤在所研究的臨床病理指標(biāo)上與MSS腫瘤無(wú)差異

13、(P>0.05)。此外，LOH總檢出率為9.52％(6/63)。有2.44％(1/41)的MSS病例同時(shí)伴有其他位點(diǎn)LOH；22.73％(5/22)的MSI病例同時(shí)伴有其他位點(diǎn)的LOH。MSI結(jié)直腸癌與MSS結(jié)直腸癌相比具有更高的LOH發(fā)生率，存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.008)。另外，18.75％(3/16)的MSI-H伴有LOH；33.33％(2/6)的MSI-L伴有LOH，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 綜上所述，多重?zé)晒釶CR-C