胞外核苷酸對(duì)人內(nèi)皮(祖)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一章胞外核苷酸對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究
　　 第一節(jié)胞外核苷酸對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響
　　 目的：
　　 觀察胞外核苷酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響。
　　 方法：
　　 采用不同濃度的胞外核苷酸(ATP，ADP，UTP，UDP)持續(xù)干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-Cs)，通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)HUVEC-Cs增殖的影響及時(shí)間效應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)觀察不

2、同濃度的ATP/ADP對(duì)HUVEC細(xì)胞周期時(shí)相分布及細(xì)胞凋亡的影響，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及免疫熒光技術(shù)觀察高濃度的ATP/ADP對(duì)誘導(dǎo)HUVEC-Cs細(xì)胞自噬的影響，免疫印記進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的自噬活動(dòng)。
　　 結(jié)果：
　　 與陰性對(duì)照組相比，ATP在低濃度(1，5，10μM)時(shí)對(duì)HUVWEC-Cs增殖沒有影響，ADP僅在1μM時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，但ATP和ADP在高濃度(50，100μM)時(shí)均顯著抑制細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間依賴性，而UTP、U

3、DP對(duì)HUVEC-Cs增殖沒有影響；高濃度的ATP/ADP并不誘導(dǎo)HUVEC-Cs凋亡，但是顯著增加S期的細(xì)胞比例，降低G2/M期的細(xì)胞比例，對(duì)G0/G1期細(xì)胞比例沒有明顯影響：細(xì)胞自噬試驗(yàn)表明高濃度的ATP/ADP顯著誘導(dǎo)LC3-GFP融合蛋白的形成，免疫印記表明對(duì)照組與ATP/ADP干預(yù)組的HUVEC-Cs均表達(dá)高水平的LC3-1和LC3-2。
　　 結(jié)論：高濃度的ATP/ADP通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯于S期并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡而

4、抑制HUVEC-Cs增殖，但并不涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 第二節(jié) ATP抑制人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　 目的：
　　 闡明ATP抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的具體機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用RT-PCR檢測(cè)靜息狀態(tài)下人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的P2Y受體亞型，RT-PCR、Western-blot檢測(cè)不同濃度的ATP對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P2Y2和P2Y11的影響；通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)非特異性P2受體

5、阻斷劑蘇拉明對(duì)ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的影響；shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)闡明介導(dǎo)ATP抑制HUVEC-Cs增殖作用的P2Y受體亞型；Western-blot檢測(cè)高濃度的ATP對(duì)Erk信號(hào)通路的活化情況，CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)ERK通路阻斷劑U0126和PD98095對(duì)ATP抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ATP對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡效應(yīng)的影響，RT-PCR及P2Y11 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)闡明其可能機(jī)制。
　　 結(jié)

6、果：
　　 1、RT-PCR結(jié)果顯示靜息狀態(tài)下，HUVEC-Cs表達(dá)高水平的P2Y2和P2Y11受體，同時(shí)表達(dá)低水平的P2Y1，4，13，14受體；原代的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)高水平的P2Y11受體，同時(shí)表達(dá)低水平的P2Y2，413，14受體；RT-PCR結(jié)果表明ATP呈濃度依賴性上調(diào)HUVEC-Cs P2Y2和P2Y11受體的mRNA表達(dá)；Western-blot結(jié)果表明ATP呈濃度依賴性上調(diào)HAECP2Y2和P2Y11受體的蛋

7、白表達(dá)。
　　 2、CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明高濃度盼ATP對(duì)HUVEC-Cs增殖的抑制作用可以被非特異性P2受體阻斷劑蘇拉明(100μM)完全阻斷。
　　 3、P2Y2和P2Y11 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC-Cs24h后，RT-PCR檢測(cè)其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明shRNA顯著下調(diào)了HUVEC-Cs P2Y2和P2Y11的mRNA表達(dá)；CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明同空白對(duì)照組相比，P2Y11 shRNA組ATP在高濃度

8、時(shí)對(duì)HUVEC-Cs增殖的抑制作用被阻斷，而P2Y2 shRNA組ATP在高濃度時(shí)仍顯著抑制HUVEC-Cs增殖。
　　 4、Western-blot結(jié)果表明ATP在100μM時(shí)呈時(shí)間依賴性活化ERK信號(hào)通路，其誘導(dǎo)ERK磷酸化的時(shí)間從1min持續(xù)到Smin，其中以4～8min時(shí)最明顯，且ATP誘導(dǎo)的ERK磷酸化可以被其特異性阻斷劑U0126所阻斷。U0126或者PD98095均可抑制或者協(xié)同ATP抑制HUVEC-Cs增殖(P<

9、0.05)，但是并不能阻斷ATP對(duì)HUVEC-Cs增殖的抑制作用。
　　 5、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明ATP在高濃度(50，100μM)時(shí)能顯著增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡效應(yīng)(與單用順鉑組相比，P<0.05)，RT-PCR結(jié)果表明ATP在高濃度時(shí)明顯下調(diào)Bcl-2及Bcl-2家族成員包括Bcl-w、Al和Mcl-1的mRNA表達(dá)水平，Western-blot結(jié)果表明，ATP可以協(xié)同順鉑降低Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。
　　 6、P2

10、Y11 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC-Cs后，ATP在高濃度(50，100μM)時(shí)下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)的效應(yīng)被部分阻斷，而且順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率明顯降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 ATP在高濃度時(shí)對(duì)HUVEC-Cs細(xì)胞增殖的抑制作用由P2Y11受體介導(dǎo)，該過(guò)程并不依賴于ERK信號(hào)通路的活化。高濃度的ATP通過(guò)P2Y11受體下調(diào)Bcl-2家族成員的基因表達(dá)水平，從而增強(qiáng)人內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

11、　　 第二章胞外核苷酸對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其機(jī)制研究
　　 第一節(jié)胞外核苷酸對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：
　　 分離純化臍帶血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞并誘導(dǎo)培養(yǎng)為內(nèi)皮祖細(xì)胞，觀察胞外核苷酸對(duì)其增殖的影響。
　　 方法：
　　 采用密度梯度離心法分離人臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞，用含有多種生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮祖細(xì)胞專用EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)學(xué)、免疫熒光及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(R

12、T-PCR)檢測(cè)并鑒定細(xì)胞的生物學(xué)特性；采用RT-PCR檢測(cè)靜息狀態(tài)下人內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)表達(dá)的P2受體亞型，并采用不同濃度的胞外核苷酸(ATP，ADP，UTP，UDP)持續(xù)干預(yù)EPCs，通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)EPCs增殖的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、分離培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞早期以集落為中心呈放射狀生長(zhǎng)，晚期形成典型的“鋪路石”樣改變，DiL-acLDL和FITC-UEA-[雙染陽(yáng)性初步鑒定其為內(nèi)皮祖細(xì)胞

13、。RT-PCR結(jié)果表明早期的EPCs表達(dá)較高水平的干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133、CD31和CD34，而弱表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物VE-Cadherin；
　　 2、RT-PCR結(jié)果顯示靜息狀態(tài)下，EPCs表達(dá)較高水平的P2X4，6，7受體和P2Y2，4，11受體，同時(shí)也弱表達(dá)P2Y13，14受體；ATP、UTP在5μM時(shí)均能上調(diào)EPCs P2Y2受體mRNA的表達(dá)；
　　 3、與陰性對(duì)照組相比，僅ATP在高濃度(50，100

14、μM)時(shí)顯著抑制EPCs增殖，而ADP、UTP、UDP對(duì)細(xì)胞增殖均沒有明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 人臍血中可分離培養(yǎng)出較高純度的內(nèi)皮祖細(xì)胞；高濃度的ATP顯著抑制EPCs增殖，但介導(dǎo)該作用的P2受體亞型有待進(jìn)一步研究。
　　 第二節(jié)胞外核苷酸對(duì)LPS誘導(dǎo)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響及可能機(jī)制
　　 目的：
　　 觀察低濃度的ATP、UTP對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響并闡明其可能

15、機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用RT-PCR檢測(cè)TLRs在EPCs中的表達(dá)情況及1mg/mL的LPS對(duì)EPCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響；采用RT-PCR檢測(cè)不同濃度的ATP、UTP(0，5，50μM)對(duì)EPCs表達(dá)TLR4、TLR4協(xié)同受體CD14和TLR調(diào)節(jié)蛋白MyD88的影響；采用RT-PCR檢測(cè)ATP、UTP在5μM濃度時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響；RT-PCR、Western-blot檢測(cè)ATP、UTP在低

16、濃度時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs表達(dá)TLR4、CD14和MyD88的影響；Western-blot檢測(cè)ATP、UTP在低濃度時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)EPCs NF-κB信號(hào)通路活化情況的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、RT-PCR結(jié)果顯示靜息狀態(tài)下，EPCs表達(dá)TLR1～10，其中TLR4的表達(dá)水平最高，其次為TLR2，TLR10和TLR3；1mg/mL的LPS能顯著上調(diào)IL-1β、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素、I

17、FN-α和TNF-α在EPCs中的mRNA表達(dá)水平；
　　 2、不同濃度的ATP、UTP(0，5，50μM)干預(yù)處理EPCs后，RT-PCR結(jié)果表明ATP、UTP在5μM濃度時(shí)能顯著下調(diào)TLR4、CD14和MyD88的mRNA表達(dá)；
　　 3、ATP、UTP在5μM濃度時(shí)能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的MCP-1，VCAM-1，IFN-α和TNF-α在EPCs中的mRNA表達(dá)水平，而對(duì)IL-1β和ICAM-1的表達(dá)無(wú)明顯影響；

18、r>　　 4、ATP、UTP在低濃度時(shí)顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的CD14和MyD88在EPCs中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)也下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TLR4mRNA在EPCs中的表達(dá)；
　　 5、ATP、UTP在低濃度時(shí)顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB磷酸化。
　　 結(jié)論：
　　 ATP/UTP在低濃度時(shí)能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子和細(xì)胞因子在EPCs中的表達(dá)，該作用可能通過(guò)P2Y2受體負(fù)性調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路，最終通過(guò)