基于功能化納米顆粒和仿生材料的生化分析新方法.pdf

1、利用免疫分析技術(shù)對復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)分析物進(jìn)行高靈敏度和高選擇性的檢測，是現(xiàn)代生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中極具吸引力的熱點(diǎn)課題之一。特別是，在臨床醫(yī)學(xué)免疫診斷中，檢測病人樣品中的痕量疾病標(biāo)志物對實(shí)現(xiàn)相關(guān)疾病的早期診斷、早期治療以及病因的探索具有極為重要的意義。目前免疫分析方法已有許多報(bào)道，但這些方法大多存在操作復(fù)雜耗時(shí)、通量低、儀器昂貴、試劑和樣品耗費(fèi)量大、對操作人員要求較高的專業(yè)技能等諸多問題。因此，開發(fā)一些快速、高通量、低成本且易于臨

2、床推廣和現(xiàn)場應(yīng)用的免疫分析新方法是一件很有價(jià)值的工作。此外，由于電化學(xué)酶生物傳感器具有靈敏度高、制造簡單、價(jià)格低廉等諸多特點(diǎn)，它們在生化分析中的應(yīng)用受到了人們越來越多的關(guān)注。但是，酶生物分子固定化技術(shù)一直是制約這類微型分析裝置快速發(fā)展與廣泛應(yīng)用的“瓶頸”。
　　 針對當(dāng)前免疫分析方法和酶生物分子固定化平臺(tái)構(gòu)建中存在的焦點(diǎn)和難點(diǎn)問題，本論文創(chuàng)新性地應(yīng)用荷葉和貽貝仿生膜，并結(jié)合使用功能化生物納米顆粒，發(fā)展了一系列單/多組分免疫檢測新

3、方法以及基于新型生物分子固定化平臺(tái)設(shè)計(jì)的電化學(xué)酶生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物的高靈敏測定。主要內(nèi)容如下：
　　 （1）探尋有效的途徑用于降低昂貴的試劑和珍貴的生物樣品的用量，將有助于降低具有諸多優(yōu)點(diǎn)的懸浮免疫分析的檢測成本，使其更易于推廣應(yīng)用。在第2章中，首次將荷葉仿生超疏水表面引入懸浮免疫分析平臺(tái)的設(shè)計(jì)。以聚碳酸酯為模型聚合物，通過選擇合適的溶劑和非溶劑，提出了一種基于非溶劑誘導(dǎo)相分離的超疏水表面制備新方法。結(jié)果表明，新方法可于

4、室溫下在多種材料基底表面上快速制備同時(shí)具有高的水的接觸角（約為160°）和低的水的滑動(dòng)角（小于5°）的超疏水聚碳酸酯膜。該膜還具有良好的抗腐蝕性能和機(jī)械穩(wěn)定性。隨后，在普通檢測試管（即10 mL 離心管）內(nèi)壁表面上修飾聚碳酸酯膜，首次制備了一種基于超疏水表面的懸浮免疫分析平臺(tái)（superhydrophobic surface-based suspensionimmunoassay platform，SSBSIP）。進(jìn)而利用該新平臺(tái)，以人

5、免疫球蛋白G（IgG）為模型分析物，發(fā)展了一種基于金增強(qiáng)納米金標(biāo)記信號(hào)放大的磁懸浮比色免疫分析新方法。研究結(jié)果表明，SSBSIP在輕微機(jī)械振蕩條件下即可實(shí)現(xiàn)懸濁反應(yīng)溶液（如免疫磁探針與樣品）的最大限度的均勻混合，形成具有較高抗原-抗體結(jié)合效率和較快免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的“循環(huán)流動(dòng)反應(yīng)體系”?；赟SBSIP的新方法僅需較小的試劑和樣品用量（如單步免疫反應(yīng)中僅需10 μL），可實(shí)現(xiàn)對人IgG的快速（如單步免疫反應(yīng)僅需20 min）、高靈敏的比色

6、檢測，檢測下限約為25 ng/mL。此外，SSBSIP 還具有自清潔能力，可反復(fù)使用。
　　 （2）日本血吸蟲病是一種古老的地方性傳染疾病，嚴(yán)重威脅著廣大疫區(qū)人民的身體健康，成為世界上亟待解決的一個(gè)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。在第3章中，應(yīng)用開發(fā)的SSBSIP 新平臺(tái)，結(jié)合銅增強(qiáng)納米金標(biāo)記信號(hào)放大策略，成功發(fā)展了一種磁電化學(xué)金屬免疫分析新方法，用于定量檢測感染兔血清中的日本血吸蟲抗體。研究結(jié)果表明，通過協(xié)同使用牛血清白蛋白-正常兔血清雙重

7、封閉試劑和免疫磁分離以將非特異性吸附影響降至最低，本方法可實(shí)現(xiàn)對濃度范圍在2 ng/mL～15 μg/mL的血吸蟲抗體的特異檢測，檢測下限約為1.3 ng/mL。與最近報(bào)道的其他血吸蟲抗體檢測方法相比，新方法在試劑和樣品用量、單步免疫反應(yīng)時(shí)間、檢測下限等方面具有顯著優(yōu)勢。用于實(shí)際樣本分析時(shí)，該方法不僅能很好地鑒定血吸蟲感染血清的感染程度，而且可獲得與經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）基本一致的結(jié)果，表明其可望用于日本血吸蟲病的臨床生化診

8、斷。
　　 （3）多組分免疫分析法，由于具有分析通量高、試劑和樣品消耗少、分析成本低等突出優(yōu)點(diǎn)，近年來成為免疫分析研究中的熱點(diǎn)之一。在第4章中，采用電化學(xué)沉積手段將廉價(jià)的鉛筆石墨上的石墨顆粒修飾上具有微米結(jié)構(gòu)的金層，制備了由金修飾石墨顆粒構(gòu)成的微電極陣列，進(jìn)而將其應(yīng)用于基于電化學(xué)阻抗圖譜的多組分免疫分析新方法研究。在單分析物實(shí)驗(yàn)中，通過結(jié)合基于納米金的信號(hào)放大策略，使用該微電極陣列的阻抗免疫傳感器可實(shí)現(xiàn)對濃度范圍在0.05～10

9、0ng/mL的人IgG模型分析物的高靈敏檢測，檢測下限約為36 pg/mL。與使用普通金電極的情況相比，該傳感器的檢測靈敏度約高出三個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，所引入的電位控制單分子層功能膜組裝（脫附）技術(shù)，可有效減少傳感器制備時(shí)間，并實(shí)現(xiàn)傳感界面的快速再生。多組分實(shí)驗(yàn)證明，同時(shí)使用多個(gè)微電極陣列平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)一個(gè)樣品溶液中多種蛋白質(zhì)的近同時(shí)電化學(xué)阻抗檢測。
　　 （4）基于硝酸纖維素膜的免疫金（-金或銀）染色法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，特別適于低收入地區(qū)

10、和發(fā)展中國家中的傳染病篩查以及蛋白質(zhì)等生化物質(zhì)的即時(shí)檢測和現(xiàn)場分析。但絕大多數(shù)的現(xiàn)有方法普遍存在一些問題，包括極低的硝酸纖維素膜利用率、不宜進(jìn)行多組分同時(shí)分析和難以有效抑制“咖啡環(huán)效應(yīng)”（導(dǎo)致所得環(huán)狀印跡不利于進(jìn)行后續(xù)的準(zhǔn)確定量分析）等。在第5章中，為了從根本上解決上述問題，實(shí)驗(yàn)通過將硝酸纖維素膜陣列組裝于超疏水聚碳酸酯功能表面，開發(fā)了一種水溶液擴(kuò)散局域化平臺(tái)（aqueous solution diffusion-localized p

11、latform，ASDLP），并將之用于發(fā)展基于免疫金-金染色的高靈敏的多組分同時(shí)比色檢測新方法。研究結(jié)果顯示，由于聚碳酸酯膜具有優(yōu)異的“排斥水（溶液）”的性質(zhì)，試劑和樣品溶液的擴(kuò)散被局限于親水硝酸纖維素膜表面，因而從根本上賦予了基于ASDLP的免疫金-金染色法各種優(yōu)點(diǎn)，包括硝酸纖維素膜具有100％的利用率、可用于多組分的同時(shí)比色檢測、可通過有效地抑制“咖啡環(huán)效應(yīng)”獲得具有均勻形貌的印跡結(jié)果以利于后續(xù)的準(zhǔn)確定量分析、非檢測區(qū)域（即白色的

12、聚碳酸酯膜）表現(xiàn)出較低的背景顏色信號(hào)、以及ASDLP可反復(fù)使用等。
　　 （5）在電化學(xué)酶生物傳感器的制備中，關(guān)鍵步驟之一就是采用合適的固定化技術(shù)把大量的酶生物分子穩(wěn)定地固定到換能器表面，并使其能保持良好的生物活性。在第6章中，合成了具有微/納階層結(jié)構(gòu)的花簇狀氧化鋅顆粒，進(jìn)而結(jié)合使用殼聚糖和納米金以構(gòu)建辣根過氧化物酶的固定化平臺(tái)，發(fā)展了一種新的無電子媒介體H2O2生物傳感器?；ù貭钛趸\顆?？蔀槔备^氧化物酶的固定提供較大的表面

13、積。殼聚糖和帶正電的氧化鋅顆粒，可分別通過物理包埋作用和靜電吸附，將大量的標(biāo)記了辣根過氧化物酶的負(fù)電性的納米金組裝到電極表面。此外，具有優(yōu)異生物相容性和導(dǎo)電性的納米金不僅可以提高辣根過氧化物酶的負(fù)載量，而且可以很好地保持辣根過氧化物酶的生物活性，并有效促進(jìn)酶與電極之間的電子傳遞。
　　 研究結(jié)果表明，通過氧化鋅顆粒和納米金的協(xié)同作用，發(fā)展的酶傳感器實(shí)現(xiàn)了對H2O2的快速、靈敏的直接電化學(xué)檢測，線性檢測范圍是1.5 μM～45 m

14、M，檢測下限約為0.7 μM。
　　 （6）基于聚合物包埋的酶生物分子固定技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)，但目前廣泛使用的各種聚合物材料（如殼聚糖）通常與基底電極的結(jié)合力較弱，容易導(dǎo)致固定的酶生物分子在洗滌和檢測過程中泄露。在第7章中，首次以貽貝仿生的高粘性聚多巴胺膜為功能基底膜并協(xié)同使用納米金，構(gòu)建了一種具有高穩(wěn)健性能的酶生物分子固定化新平臺(tái)。進(jìn)而以固定辣根過氧化物酶為例，發(fā)展了一種新的電化學(xué)酶傳感器用于H2O2的測定。結(jié)果表明，借助高生物