基于功能核酸的納米組裝與生物傳感的新方法研究.pdf

1、功能核酸是指具有特殊功能的核酸分子，一般來說包括兩大類:一類是與抗體性質相似，能夠與目標分子特異性結合的DNA/RNA，稱為核酸適配體（Aptamer）[1];另一類與蛋白酶催化活性類似的核酸分子，稱為DNA酶(DNAzymes)[2-4]。功能核酸的出現(xiàn)突破了人們觀念中核酸只能作為遺傳物質和轉運載體的認識，為科員人員的研究提供了新的平臺。
　　近年來，納米材料由于其獨特的光學和電化學性能，已成為當前研究的熱點，得到越來越廣泛的應

2、用。尤其是，DNA本身也可以組裝成納米材料，為生命科學、材料科學、環(huán)境科學等領域帶來前所未有的推動作用，因此備受廣大科研工作者的關注。例如，DNA分子可以作為強大的合成積木單元用于納米材料的組裝。然而，傳統(tǒng)的方法組裝尺寸較大且復雜的DNA納米結構需要大量的不同序列的DNA鏈，導致其設計過程復雜。大量的DNA需求量也會導致其準備過程過長。并且，在變性條件（如尿素，酶）下，以及極低濃度條件下，會伴隨著DNA結構的解離。如何使用簡便的方法合成

3、穩(wěn)定的DNA納米材料仍是亟待解決的問題。
　　同時，核酸的穩(wěn)定性和適應性高，并可以快速的通過商業(yè)的DNA合成儀合成。鑒于納米技術和功能核酸兩者研究取得的巨大進步，本論文很自然地結合這兩個領域，創(chuàng)造新的跨學科領域，合成新的DNA納米結構，開發(fā)低成本、操作簡便以及高靈敏的新型納米生物傳感技術，并成功實現(xiàn)抗癌藥物的運輸。
　　其主要內(nèi)容如下:
　　第2章描述了一種基于DNA酶的酶聯(lián)免疫(ELISA)法，稱為DLISA，用于代

4、替蛋白質酶用于ELISA的檢測。這種三重擴增的DLISA平臺運用分子信標體系和離子交換擴增反應，是一種可以替代經(jīng)典ELISA的免疫測定法一般來說，ELISA使用一種酶，通常是過氧化物酶或堿性磷酸酶，催化底物轉化成有色的或高熒光的產(chǎn)物從而進行定量分析。傳統(tǒng)的ELISA是一種配體結合測定法，它需要在固體表面固定一個連接試劑，這個連接試劑需要使用蛋白質酶做為生物催化劑來達到信號放大的檢測。然而，在一些苛刻的條件下，例如在高溫或重金屬離子（如汞

5、）存在時，蛋白質酶的活性會發(fā)生不可逆的變性，導致ELISA在實際樣品中的應用大大的降低。為了驗證這個想法，人IgG同種型抗體和前列腺特異性抗原(PSA)作為模型抗原/抗體檢測體系。所提出的DLISA免疫測定方法對人類IgG檢測具有超高的靈敏度，檢測下限為2 fg/mL(3×10-17 M)，這個靈敏度相當于在100μL體系樣品中能夠檢測到1800個分子，這種DLISA檢測方法比傳統(tǒng)的ELISA或其他報道免疫測定方法的靈敏度高很多。DNA

6、酶是源于自組合的寡核苷酸庫體外篩選分離的核酸序列。相比于蛋白質，核酸的穩(wěn)定性和適應性更高，并且它們可以通過市售的DNA合成儀容易的制備。此外，DNA酶的催化和裂解活性在溶液中進行。因此，在檢測過程中，它不需要酶的固定，穩(wěn)定性能夠大大的提高。DLISA檢測平臺構建了傳感陣列，可實現(xiàn)多個目標物的瞬時檢測。以人IgG，兔IgG，鼠IgG作為目標分子，都得到了滿意的實驗結果，證明所提出的DLISA免疫測定法擁有多目標檢測的能力。
　　第3

7、章基于雙鏈DNA-銅納米顆粒熒光探針，本文構建了一種非標記且高靈敏的生物傳感器用于核酸酶活性的檢測。當?shù)蜐舛鹊腃u2+存在時，雙鏈DNA能為銅納米顆粒的形成提供模板，所合成的銅納米顆粒具有較高的熒光;而單鏈DNA不能進行這個反應。利用這一特性用于核酸酶活性的檢測。在實驗中，以S1核酸酶為模型分析物，S1核酸酶是一種單鏈高度特異的核酸酶。當體系中S1核酸酶存在時，核酸酶會切割DNA成為短鏈DNA或單核苷酸，因此銅納米顆粒不能形成，傳感系統(tǒng)

8、的熒光強度低。在最優(yōu)的實驗條件下，該傳感器對S1核酸酶的檢測下限為0.3 U/mL。
　　第4章在本章中，首次報道了將陽離子聚集態(tài)的苝(PDI)作為無標記的光譜猝滅劑。當它聚集在DNA時，PDI能夠有效地猝滅DNA上標記的發(fā)射波長在可見光到近紅外范圍內(nèi)的熒光基團的熒光，并且這種廣譜猝滅劑可通過無標記的方式。基于聚集態(tài)的苝與外切酶Ⅲ輔助的目標循環(huán)放大相結合，本文構建了一個后添加、靈敏檢測DNA的多目標檢測分析平臺。這種光譜猝滅劑不影

9、響酶的活性。不論是后添加或前添加的方法法，該傳感體系獲得相同的對DNA檢測的檢測下限。此外，該傳感體系具有較好的選擇性。在均相溶液中，通過所提出的感測系統(tǒng)能夠同時實現(xiàn)多目標DNA序列的分析。
　　第5章基于大自然的啟發(fā)，應用于生物醫(yī)學領域。本章中，基于滾環(huán)復制反應(RCR)，本文提出了一種非經(jīng)典的、自組裝的DNA納米花結構。這種DNA納米花結構的自組裝方法只需要兩條DNA鏈，它的自組裝通過液體結晶的方式，不依賴于Watson-Cr

10、ick堿基配對，避免了傳統(tǒng)DNA結構通過復雜設計來達到鏈間和鏈內(nèi)的雜交而進行的自組裝。調節(jié)滾環(huán)復制的時間可以控制DNA納米花的尺寸從200納米到4微米間變化，不同尺寸的DNA納米花將使它的應用更為廣泛。并且，DNA納米花能抗酶降解，在低濃度，高溫和尿素變性的條件下都能穩(wěn)定的存在。DNA納米花的高穩(wěn)定性歸因于它獨特的性質:包括長鏈的、無缺口的DNA積木結構單元，DNA的密度凝聚，大量的鏈間和鏈內(nèi)DNA結構單元的交織。高度穩(wěn)定的DNA納米花

11、結構能夠使它在復雜環(huán)境下廣泛的應用，例如:臨床診斷、生物醫(yī)學和生物技術等。通過合理的設計，在DNA的自組裝過程中，各種功能團分子能夠嵌入DNA結構中。并且所合成的DNA納米花可以進一步用于生物熒光成像、選擇性的識別腫瘤細胞和靶向藥物傳遞等。
　　在第6章利用相似的原理，本文報導了一種基于滾環(huán)復制反應合成核酸適配體修飾的熒光能量共振轉移的DNA納米花的簡便方法，并且將這種DNA納米花應用于單一波長激發(fā)的多色成像和可跟蹤的藥物釋放。三

12、種熒光染料，熒光素FAM，花箐素染料Cy3和羅丹明ROX，通過化學方法修飾的脫氧核苷酸（FAM-dUTP，Cy3-dUTP和ROX-dUTP）嵌入到DNA納米花中。在滾環(huán)復制的酶促反應中，可以改變熒光染料的比例調節(jié)熒光能量共振轉移介導的熒光發(fā)射。在單一波長激發(fā)下，DNA納米花能夠顯示出多個熒光發(fā)射光譜。與第5章類似，DNA納米花自組裝通過DNA液體結晶的方式，不依賴于Watson-Crick堿基配對，避免了傳統(tǒng)DNA自組裝結構需要的復雜