基于超順磁性四氧化三鐵磁性納米顆粒的惡性膠質(zhì)瘤靶向聯(lián)合基因治療.pdf

1、第一章 目的：制備能夠應(yīng)用于膠質(zhì)瘤靶向聯(lián)合基因治療的四氧化三鐵磁性納米顆粒，建立以超順磁性Fe3O4磁性納米顆粒為基因載體的膠質(zhì)瘤基因治療基因轉(zhuǎn)運(yùn)體系，并評(píng)價(jià)該體系的體外基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率。 方法：以2-吡咯烷酮和乙酰丙酮鐵為原料，采用高溫分解鐵有機(jī)物法是將鐵前驅(qū)體高溫分解得到鐵原子，再由鐵原子生成鐵納米顆粒，將鐵納米顆?？刂蒲趸玫剿难趸F納米顆粒；再以偶聯(lián)劑γ-氨丙基三乙氧基硅烷(NH2C3H6Si(OC2H5)3)對(duì)F

2、e3O4磁性納米顆粒(Fe3O4 magnetic nanoparticle，F(xiàn)e3O4 MNP)表面修飾；將CD基因轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，得到U251-CD細(xì)胞，免疫熒光染色檢測(cè)本體系的轉(zhuǎn)染效率。通過Fe3O4MNP與質(zhì)粒pCMVCD結(jié)合試驗(yàn)，F(xiàn)e3O4MNP-pCMVCD復(fù)合物的DNase-I消化，血清消化保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)Fe3O4 MNP結(jié)合DNA的能力及對(duì)DNA的保護(hù)效果。采用RT-PCR、Westem blotting，和高

3、效液相色譜法等檢測(cè)CD基因的mRNA水平和CD蛋白水平，U251-CD細(xì)胞。MTT法測(cè)定檢測(cè)U251-CD細(xì)胞的5-FC化療效果及旁觀者效應(yīng)。 結(jié)果：制備出穩(wěn)定性好、單分散、粒徑小、粒徑分布范圍窄(10±2nm)的磁性Fe3O4/氨基硅烷復(fù)合納米顆粒，以γ-氨丙基三乙氧基硅烷作分散穩(wěn)定劑，改善了磁性Fe3O4納米顆粒表面的疏水環(huán)境，有效地阻止了四氧化三鐵納米顆粒團(tuán)聚的發(fā)生。當(dāng)Fe3O4MNP與質(zhì)粒pCMVCD質(zhì)量比為0.05：1

4、時(shí)，結(jié)合的質(zhì)粒量<20％；當(dāng)二者質(zhì)量比為1：1時(shí)，幾乎可以結(jié)合體系中的全部質(zhì)粒。Fe3O4MNP-pCMVCD復(fù)合物能夠保護(hù)質(zhì)粒pCMVCD免受Dnase-I及血清的消化作用，保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。使用Fe3O4ⅣrNP作為載體成功將CD基因成功轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞有CD基因穩(wěn)定表達(dá)，呈時(shí)間相關(guān)性增強(qiáng)表達(dá)模式(轉(zhuǎn)染后5天內(nèi)呈現(xiàn)表達(dá)持續(xù)增加模式)，轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)照組。Fe3O4 MNP的轉(zhuǎn)染效果與Fe3O4 MNP的用量呈正

5、相關(guān)，且無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，經(jīng)MTT檢測(cè)Fe3O4 MNP在50mg/L以下時(shí)不影響U251細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。U251-CD細(xì)胞加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)出U251-CD細(xì)胞生成的高濃度5-氟尿嘧啶。能顯著的抑制U251細(xì)胞生長(zhǎng)。U251與U251-CD混合細(xì)胞中，在加入5-FC(終濃度1000uml/L)后，10％的U251-CD細(xì)胞可以殺滅20~30％的U251與U251-CD混合細(xì)胞與對(duì)照組(

6、O％組)相比P<0.01，15％的U251-CD細(xì)胞可以殺滅約50％U251與U251-CD的混合細(xì)胞；30％的U251-CD細(xì)胞可以殺滅約80％U251與U251-CD的混合細(xì)胞：50％以上的U251-CD細(xì)胞可以完全的殺滅U251與U251-CD的混合細(xì)胞。 結(jié)論：制備的經(jīng)γ-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的Fe3O4磁性納米顆粒粒徑小，生物相容性提高，達(dá)到作為基因載體應(yīng)用于膠質(zhì)瘤靶向聯(lián)合基因治療要求。超順磁性Fe3O4納米顆?；?/p>

7、轉(zhuǎn)運(yùn)體系在體外U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系應(yīng)用中轉(zhuǎn)染效果顯著。Fe3O4MNP/CD/5-FC膠質(zhì)瘤基因治療系統(tǒng)應(yīng)用于膠瘤基因治療體外試驗(yàn)抑瘤效果突出，可應(yīng)用于下一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 第二章 目的:在第一章的Fe3O4MNP/CD/5-FC膠質(zhì)瘤基因治療系統(tǒng)成功研發(fā)的基礎(chǔ)上，為優(yōu)化該基因治療系統(tǒng)，研發(fā)wt-p53、wt-p16基因聯(lián)合胞嘧啶脫氨酶( Cytosine Deaminase，CD)/5-FC系統(tǒng)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的可行

8、性，以期能提高膠質(zhì)瘤化療效果及逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性。 方法:分離培養(yǎng)并鑒定U251細(xì)胞系及30例臨床膠質(zhì)瘤病理標(biāo)本(WHOⅢ級(jí)、IV級(jí))的膠質(zhì)膠干細(xì)胞。利用Fe3O4MNP為基因載體分別將質(zhì)粒pCDNA3.1-p16、pYD5-p53，及pCMVCD轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞、各組病理組織分離的膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma stemcells，GSC)。采用RT-PCR、Western blotting檢

9、測(cè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染后在相應(yīng)的細(xì)胞中的表達(dá)情況。MTT法檢測(cè)不同基因治療方案的U251細(xì)胞及U251GSC細(xì)胞的對(duì)CD/5-FC的治療敏感性；并檢測(cè)四種臨床常用化療藥物VM-26，VP-16，TMZ，5-FU對(duì)不同基因治療方案的U251及U251GSC的生長(zhǎng)抑制率。使用AnnexinV-PI雙染法對(duì)10例病理標(biāo)本分離出來(lái)的并經(jīng)轉(zhuǎn)染后的各組Ⅲ～I(xiàn)V級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞實(shí)施不同的基因治療方案后的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果:成功以Fe3O4 MN

10、P為載體將wt-p53、wt-p16，及CD基因轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞、30例病理標(biāo)本分離出來(lái)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，及其膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)。RT-PCR、Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的目標(biāo)基因表達(dá)情況無(wú)差別(p<0.01)。體外轉(zhuǎn)染wt-p53、wt-p16基因都能明顯提高CD/5-FC人對(duì)U251細(xì)胞系的化療效果。以VM-26、VP16、TMZ，5-FU的1倍血漿峰濃度值的細(xì)胞增殖抑制率，各化療藥物組對(duì)U

11、251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖均有不同程度的抑制，以TMZ效果最好；但U251GCS對(duì)各種化療敏感度均較U251細(xì)胞明顯下降(p<0.01)，其中TMZ效果最好；P53/P16轉(zhuǎn)染組U251GCS對(duì)VM-26、VP16、TMZ，5-FU的敏感性較U251GCS均明顯提高(p<0.01)，TMZ效果仍是最好。對(duì)10例病理標(biāo)本分離出來(lái)的并經(jīng)轉(zhuǎn)染后的各組Ⅲ～I(xiàn)V級(jí)膠質(zhì)干瘤細(xì)胞實(shí)施不同的基因治療方案后的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示CD/P53/P1

12、6聯(lián)合組膠質(zhì)干瘤細(xì)胞凋亡率(46.32±12.78％)高于對(duì)照組(1.53±1.22％)及P53(30.1±10.45％)、P16(33.10±9.89％)單獨(dú)轉(zhuǎn)染組(p<0.01)。CD/P53/P16/5-FC組(89.87±9.02％)明顯高于CD/P53/P16/5-FU組(60.18±6.23％)(p<0.01)。 結(jié)論:基于Fe3O4磁性納米基因載體的p53、p16聯(lián)合CD/5-FC系統(tǒng)基因治療體系可作為臨床上膠質(zhì)瘤

13、治療方案的一種可能選擇，可在體外有效的殺滅膠質(zhì)瘤細(xì)胞及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，該基因治療系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的機(jī)理與凋亡相關(guān)。另外，該體系能逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)多種臨床常用的化療藥物的耐藥性，明顯提高化療效果。 第三章 Fe3O4 MNP介導(dǎo)CD/5-FC系統(tǒng)聯(lián)合wt-p53及wt-p16治療惡性膠質(zhì)瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 目的：Fe3O4磁性納米基因載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效果及靜脈注射時(shí)體內(nèi)分布情況。在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞裸鼠皮下成瘤動(dòng)物模型中驗(yàn)證

14、本課題研發(fā)的“基于Fe3O4磁性納米基因載體的p53、p16聯(lián)合CD/5-FC系統(tǒng)基因治療體系”的治療效果。實(shí)施體內(nèi)磁靶向定位基因治療，并觀察該基因治療體系的全身副作用。 方法：建立膠質(zhì)瘤干細(xì)胞皮下荷瘤裸鼠模型。原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)Fe3O4MNP在裸鼠體內(nèi)的磁靶向定位效果及體內(nèi)分布情況。免疫組化檢測(cè)各目標(biāo)基因的蛋白在動(dòng)物模型膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，并采用TUNEL原位凋亡試劑盒檢測(cè)各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。效液相色譜法檢測(cè)5-F

15、C體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-FU情況。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同基因治療方案下各組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤體積，計(jì)算抑瘤率，評(píng)定治療效果，并觀察裸鼠體重的變化。對(duì)比CD/P53/P16轉(zhuǎn)染組5-FC與5-FU的治療效果及全向副作用。 結(jié)果：成功建立膠質(zhì)瘤干細(xì)胞皮下荷瘤裸鼠模型，一般在接種后14d可見較明顯皮下結(jié)節(jié)的形成。在體外腫瘤表面施加4000高斯磁場(chǎng)時(shí)，鼠尾靜脈注射磁性納米顆粒溶液后45min，實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織鐵元素含量(μg/g)為91.

16、46±19.94，遠(yuǎn)高于對(duì)照組30.23±6.34，(p<0.01)。說明在磁場(chǎng)作用下Fe3O4MNP定向向腫瘤組織移動(dòng)，大量聚集在腫瘤組織內(nèi)造成鐵元素含量明顯升高，另外腦組織鐵含量也較正常對(duì)照組明顯升高p<0.01>，說明Fe3O4MNP透過血腦屏障能力顯著。wt-p53、wt-p16能夠顯著的裸鼠荷瘤的體積，并減少荷瘤裸鼠體重的下降。荷瘤裸鼠BALB/c-CD/p53/p16腹腔注射5-FC后Sd起皮下腫瘤體積明顯縮小，經(jīng)高效液相色

17、譜對(duì)腫瘤組織均漿檢測(cè)出5-FU。而荷瘤裸鼠BALB/c-CD/p53/p16腹腔注射5-FU后1M內(nèi)腫瘤體積未見縮小，反而進(jìn)行性惡化。5-FC治療組對(duì)裸鼠骨髓抑制、血常規(guī)、肝功能影響明顯小于5-FU治療組(p<0.01)。各組荷瘤裸鼠TUNEL檢測(cè)凋亡情況結(jié)果與第二章體外檢測(cè)結(jié)果一致。對(duì)12例不同的膠質(zhì)瘤病理組織分離培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞裸鼠皮下形成的膠質(zhì)瘤行體內(nèi)Fe3O4MNP介導(dǎo)的CD/p53/p16基因治療。12例中原病理組織P53，

18、P16免疫組化陽(yáng)性率均為25％，基因治療總有效率為33070(4/12)，微效率為25％(3/12)，無(wú)效率為25％(3/12)，惡化率為17％(1/12)。 結(jié)論：基于Fe3O4磁性納米基因載體的p53、p16聯(lián)合CD/5-FC系統(tǒng)基因治療體系可作為臨床上膠質(zhì)瘤治療方案的一種可能選擇，可在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞皮下荷瘤裸鼠模型體內(nèi)有效抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，在5-FC治療時(shí)能有效的縮小己生成膠質(zhì)瘤體積，該基因治療系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的機(jī)理與凋