多肽介導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤靶向納米基因給藥系統(tǒng).pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的腦腫瘤，也是死亡率最高的10類腫瘤之一。由于腦膠質(zhì)瘤自身的浸潤性生長特點(diǎn)以及血腦屏障(BBB)的存在，使得目前常用的治療手段包括手術(shù)切除、放療、化療等均難以達(dá)到良好的治療效果?；蛑委熓且环N極具潛力的治療手段，但是基因藥物難以自主向膠質(zhì)瘤富集，需要構(gòu)建具有主動(dòng)靶向性質(zhì)的基因藥物遞釋系統(tǒng)，使得外源性基因藥物在病灶部位實(shí)現(xiàn)廣泛表達(dá)。
　　本課題針對腦膠質(zhì)瘤生長過程中BBB的生理特點(diǎn)，設(shè)想兩種構(gòu)建基因藥物遞釋系統(tǒng)的

2、策略：(1)在腦膠質(zhì)瘤晚期，BBB受到破壞，此時(shí)腦膠質(zhì)瘤與其他腫瘤類似，具有EPR效應(yīng)，在此基礎(chǔ)上采用膠質(zhì)瘤靶向頭基修飾則能進(jìn)一步提高藥物在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的濃集；(2)在腦膠質(zhì)瘤早期，BBB保持完整，選用對BBB、膠質(zhì)瘤細(xì)胞高親和性多肽作為靶向頭基可能實(shí)現(xiàn)跨越BBB、靶向膠質(zhì)瘤。
　　基于以上兩種策略，本課題通過藥劑學(xué)、高分子學(xué)和生物學(xué)手段的交叉應(yīng)用，以陽離子高分子聚酰胺-胺(PAMAM)為基礎(chǔ)載體高分子，通過親水性高分子聚乙二醇(

3、PEG)連接膠質(zhì)瘤靶向多肽CTX或BBB-膠質(zhì)瘤雙靶向多肽Angiopep，與基因復(fù)合形成PAMAM-PEG-CTX/DNA和PAMAM-PEG-Angiopep/DNA納米粒。這兩種納米給藥系統(tǒng)具有以下特征：(1)所采用的基因載體PAMAM是近年發(fā)展起來的新型陽離子高分子材料，易于修飾，載基因能力較高；(2)選用的CTX是一段特異性與膠質(zhì)瘤細(xì)胞結(jié)合的多肽，能提高納米粒的膠質(zhì)瘤靶向性；(3)選用的Angiopep是一段與BBB和膠質(zhì)瘤細(xì)

4、胞均具有高親合力的多肽，能夠協(xié)助納米粒穿越BBB后進(jìn)一步向膠質(zhì)瘤細(xì)胞濃集。
　　本文第一章對腦膠質(zhì)瘤的生理特點(diǎn)及治療手段進(jìn)行了概述。腦膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見且最難治愈的疾病，除了具有一般腫瘤的基本特征外，還有自身的特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為浸潤性生長和“韭菜樣”再生增殖的特點(diǎn)[1，2]。隨著腫瘤生成過程中腫瘤細(xì)胞與星形細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，血腦屏障逐漸受到破壞[3]。目前腦膠質(zhì)瘤常用的治療手段包括手術(shù)切除、放療和化療，但是各自存在缺點(diǎn)且

5、療效不佳?；蛑委熓菢O具潛力的新型治療手段。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是最近發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號分子，具有TNF家族成員的許多特性[4]，能夠特異性與膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合誘導(dǎo)凋亡，但不殺傷正常細(xì)胞。本研究采用編碼TRAIL蛋白的質(zhì)粒pORF-TRAIL作為基因藥物，以PAMAM為基礎(chǔ)載體，針對腦膠質(zhì)瘤生長過程中BBB的生理特點(diǎn)，采取膠質(zhì)瘤

6、靶向和BBB-膠質(zhì)瘤雙靶向兩種策略構(gòu)建出兩種基因藥物遞釋系統(tǒng)。分別選用CTX和Angiopep兩段多肽為靶向頭基，其中CTX能通過與膠質(zhì)瘤細(xì)胞高量表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)結(jié)合形成MMP-2-CTX復(fù)合物后被膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異性攝取，具有膠質(zhì)瘤靶向作用[5]；而Angiopep則是通過膠質(zhì)瘤細(xì)胞和BBB上均表達(dá)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞[6]，從而實(shí)現(xiàn)BBB-膠質(zhì)瘤雙靶向。
　　本文第二章第一節(jié)對PA

7、MAM-PEG-CTX高分子載體及其載基因納米粒的體外性質(zhì)進(jìn)行了評價(jià)。CTX修飾后能特異性增加載體高分子在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的攝取，而在正常細(xì)胞(293細(xì)胞)上的攝取則不受影響。載體高分子在C6細(xì)胞上的攝取在4℃時(shí)受到抑制，說明載體可能通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。CTX修飾后的載基因納米粒在C6細(xì)胞的攝取也明顯增加。
　　第二節(jié)考察了PAMAM-PEG-CTX/DNA載基因納米粒在荷腦膠質(zhì)瘤小鼠的體內(nèi)分布、腦內(nèi)表達(dá)，并對納米粒治療腦膠質(zhì)瘤

8、進(jìn)行了藥效學(xué)評價(jià)。與未修飾的PAMAM/DNA納米粒相比，PAMAM-PEG-CTX/DNA能夠增加納米粒在荷腦膠質(zhì)瘤小鼠腫瘤部位的聚集。冰凍切片結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-CTX/DNA納米粒在膠質(zhì)瘤邊緣部位的腫瘤組織有較明顯的表達(dá)，而PAMAM/DNA則在膠質(zhì)瘤邊緣部位的正常組織部分有少量表達(dá)，這可能與腫瘤的新生血管與血腦屏障相關(guān)。藥效學(xué)評價(jià)結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL納米粒能夠誘導(dǎo)荷瘤小鼠腦膠質(zhì)瘤內(nèi)

9、部的腫瘤細(xì)胞凋亡，效果與市售的口服藥物替莫唑胺相當(dāng)，而PAMAM/pORF-TRAIL則能在膠質(zhì)瘤邊緣引發(fā)細(xì)胞凋亡；PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL和替莫唑胺組的荷瘤小鼠中位存活時(shí)間分別為59.5天和49天，且PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL組50％的小鼠存活時(shí)間超過70天，而替莫唑胺組的存活時(shí)間均小于70天。以上結(jié)果說明PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL能有效治療腦膠質(zhì)瘤。
　　第三

10、章第一節(jié)對PAMAM-PEG-Angiopep高分子載體及其載基因納米粒的體內(nèi)外性質(zhì)進(jìn)行了評價(jià)。Angiopep修飾后能夠增加載體在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCECs)上的攝取，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度依賴性。攝取機(jī)理考察結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-Angiopep載體高分子及其載基因納米?？赡芡ㄟ^LRP介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑被BCECs攝取。Angiopep修飾后能提高載基因納米粒跨BCECs單層的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。體內(nèi)分布結(jié)果顯示，Angiopep

11、修飾能增加載基因納米粒的腦內(nèi)分布，且隨Angiopep修飾的比例上升而增加；同時(shí)，Angiopep的修飾能夠有效增加外來基因在小鼠腦內(nèi)各部位的表達(dá)效率。PAMAM-PEG-Angiopep/DNA載基因納米粒顯示出良好的腦靶向效率。
　　第二節(jié)考察了PAMAM-PEG-Angiopep/DNA載基因納米粒在荷腦膠質(zhì)瘤小鼠的體內(nèi)分布，并對納米粒治療腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行了藥效學(xué)評價(jià)。與未修飾的PAMAM/DNA納米粒相比，PAMAM-PEG-

12、Angiopep/DNA能夠增加納米粒在荷腦膠質(zhì)瘤小鼠腫瘤部位的聚集，可能的原因是納米粒在Angiopep介導(dǎo)穿越BBB后進(jìn)一步向膠質(zhì)瘤細(xì)胞濃集，顯示出BBB-膠質(zhì)瘤雙靶向作用。藥效學(xué)評價(jià)結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-Angiopep/pORF-TRAIL納米粒能夠誘導(dǎo)荷瘤小鼠腦膠質(zhì)瘤內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞凋亡；PAMAM-PEG-Angiopep/pORF-TRAIL和替莫唑胺組的荷瘤小鼠中位存活時(shí)間分別為56.5天和49天，二者的整體存活時(shí)