經(jīng)核苷類藥物治療的慢乙肝患者RT基因和S基因序列特點(diǎn)分析.pdf

1、研究背景:
　　 盡管乙肝病毒疫苗已經(jīng)在全球多數(shù)國家廣泛應(yīng)用，但乙型病毒性肝炎(HepatitisBvirus，HBV)呈全球性分布，目前全球仍有超過3.5億的慢性乙肝病毒感染者(ChronichepatitisBvirus，CHB)，其中有些已經(jīng)發(fā)展為失代償性肝病、肝硬化、原發(fā)性肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)。2006年我國乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，1～59歲人群HBsAg攜帶率為7.18％

2、，5歲以下兒童的HBsAg攜帶率僅為0.96％。目前拉米夫定(Lamivudine，LAM)、阿德福韋(Adefovirdipivoxil，ADV)、替比夫定(Telbivudine，LDT)和恩替卡韋(Enticavir,ETV)等已經(jīng)在我國批準(zhǔn)用于治療CHB患者，然而由于LAM、ADV、LDT等藥物耐藥屏障較低，HBV耐藥發(fā)生率較高，其中拉米夫定耐藥率最高，5年可達(dá)80％，YMDD變異是目前最常見的耐藥突變。由于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(Re

3、versetranscriptase，RT)基因和編碼HBsAg的S基因是完全重疊的，故HBVRT發(fā)生耐藥突變可能會導(dǎo)致S基因出現(xiàn)變異，進(jìn)而影響HBsAg的編碼和抗原活性，反之亦然。
　　 HBsAg是HBV顆粒的表面包膜蛋白，是HBV的保護(hù)性抗體(HBsAb)作用的主要靶抗原，尤其是主要親水區(qū)(Majorhydrophilicregion，MHR)，該區(qū)域編碼位于HBsAg的99-169位氨基酸。S基因出現(xiàn)突變以后可能會導(dǎo)致疫

4、苗免疫逃避和HBsAg不能被常規(guī)商業(yè)化診斷試劑所識別，也可能會增加隱匿性乙型肝炎感染(OcculthepatitisBinfection，OBI)的發(fā)生率，甚至?xí)又馗闻K疾病的進(jìn)展。體外和動物研究顯示當(dāng)S基因出現(xiàn)sW182*/rtV191I，sW172*/rtA181T和sW196*/rtM204I等突變可能會導(dǎo)致HCC的發(fā)生率增加。那么這些編碼HBsAg的S基因在經(jīng)核苷類藥物治療的患者中突變情況如何呢？目前尚無明確和系統(tǒng)的報道。

5、>　　 研究目的:
　　 1、探討經(jīng)核苷類藥物治療后耐藥患者其基因型和耐藥突變類型之間的關(guān)系。
　　 2、研究出現(xiàn)YMDD耐藥突變患者的耐藥相關(guān)S基因突變情況和S基因終止突變分布規(guī)律。
　　 3、研究ADV耐藥突變患者耐藥相關(guān)S基因突變情況和S基因終止突變分布規(guī)律
　　 4、比較經(jīng)核苷類藥物治療后的未耐藥患者、YMDD突變患者、ADV耐藥患者S基因MHR區(qū)突變特點(diǎn)。
　　 5、探討不確定的基因型

6、的序列特征。
　　 研究材料和方法:
　　 1.樣本來源:從2009年12月至2011年12月就診于廣州南方醫(yī)院、佛山市第一人民醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院的患者，分別為1161例、61例、148例。上述所有患者均接受核苷類藥物治療且臨床懷疑或監(jiān)測耐藥，HBeAg陽性或陰性，無HIV、HCV、HDV等感染史，收集所有患者血清，并儲存于-30C。
　　 2.HBVDNA提取:收集患者血清，使用凱杰公司的QIAampDNAB

7、loodMiniKit，根據(jù)操作說明從200微升血清中提取HBVDNA用于下一步操作。
　　 3.HBVDNA逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(ReverseTranscriptaseregion，RT)擴(kuò)增:使用巢式PCR對HBVRT區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，對其擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿公司測序。
　　 4.測序結(jié)果分析:從Genebank中下載從A型—G型和I型序列作為參考序列，使用CLUSTALW對序列進(jìn)行比對，并使用HBVS區(qū)做進(jìn)化樹進(jìn)行基因分型，htt

8、p://lifecenter.sgst.cn/hbv/cnv/search、http://hivdb.stanford.edu/HBV/HBVseql和http://hbv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php等在線序列網(wǎng)站對序列的基因型、耐藥突變位點(diǎn)、S基因突變情況進(jìn)行分析確認(rèn)。對于基因分型不確定的進(jìn)行全長擴(kuò)增，并使用NCBI的基因型分型工具進(jìn)一步分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

9、projects/genotyping/formpage.cgi)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，率的比較用x2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)，所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.HBV患者基因型和耐藥突變類型分析:
　　 1.1.基因型分析
　　 共有773例PCR陽性，并且成功測序。其中B型342例(44.2

10、4％)，C型428例(55.37％)，D型1例(0.13％)，不確定型2例(0.26％)。2例不確定型序列在不同的在線耐藥檢測網(wǎng)站中分別被判定為G型或I型，我們對其中1例進(jìn)行了全長擴(kuò)增，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)該序列可能為I基因型，NCBI分型工具提示可能為不同基因型的重組所致，BLAST比對發(fā)現(xiàn)與廣西發(fā)現(xiàn)的X/C重組體有98％的相似性，且該患者亦為廣西患者，故將其判定為X/C重組體，最近有研究者將該株病毒命名為“I”基因型。
　　 1.2.

11、YMDD突變患者耐藥突變類型分析
　　 有211例(27.30％)患者具有YMDD突變，13種突變類型，其中rtM204I單獨(dú)突變最多有103例(48.82％)，B基因型和C基因型分別占57例和46例，該突變在B和C基因型中的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P=0.148，X2=2.096);其次是rtM204V＋rtL180M突變有49例(23.22％)，包括B基因型和C基因型分別為37例(34.91％，37/106)和13例(12.38％

12、，13/105)，該突變在兩個基因型中的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，X2=14.801);rtM204I＋rtL180M突變有20例(9.48％)，包括B型4例和C型16例，該突變類型更多的分布于C基因型，且兩種基因型之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004，X2=8.08);rtM204V＋rtL180M＋rtV173L則全部分布于C基因型，且B和C基因型之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P=0.001，X2=11.716)。
　　

13、 1.3.ADV耐藥患者突變類型分析:
　　 在所有患者中共檢測到82例(10.61％)患者具有ADV耐藥突變，B和C基因型分別有31例和51例。這些患者共有14種耐藥突變類型，其中rtA181V、rtA181T、rtN236T、rtA181T＋rtN236T和rtN181V＋rtN236T分別有20例、17例、15例和12例，其中rtN236T突變在B型和C型分別有13例和2例，該突變在兩種基因型的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0

14、.001，X2=18.641)。rtA181S/I、rtA181G＋rtT184G、rtA181T＋rtM250L、rtMA181T＋rtN236T＋rtM250L、rtA181V＋rtL180M和rtA181T＋rtN236T＋rtV173L等突變亦可檢測到。
　　 2.常見耐藥突變位點(diǎn)所對應(yīng)的S基因突變特點(diǎn)分析
　　 2.1.YMDD突變患者耐藥相關(guān)的S基因突變特點(diǎn)
　　 rtM204I可以導(dǎo)致S基因出現(xiàn)sW

15、196L、sW196S和sW196*三種類型的突變，本研究中分別有110例(B型45例和C型65例)、22例(B型17例和C型5例)和2例(B型1例和C型1例)出現(xiàn)上述三種類型的突變。其中sW196L突變主要分布于C基因型(P=0.002，X2=9.192)，而sW196S突變則在B基因型中分布較多(P=0.002，X2=9.674)，sW196*僅有2例(B型和C型患者各有1例)。77例rtM204V突變則僅導(dǎo)致sI195M突變。rt

16、V173L突變導(dǎo)致sE164D突變，本研究中所有rtV173L/sE164D均分布于C基因型，C基因型和B基因型的這種差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 2.2.ADV耐藥患者所對應(yīng)的S基因突變特點(diǎn)
　　 與以往的研究類似，rtA181T突變多數(shù)可以導(dǎo)致sW172*突變，但是該耐藥突變亦可導(dǎo)致sW172V和sW172L突變，且后一種突變共有6例均分布于C基因型中。rtA181V/G/I/S突變分別可以導(dǎo)致S基因

17、出現(xiàn)sL172F、sL173V、sW172*和sW172C三種類型的突變，其中rtA181I/sW172*突變在未見以往文獻(xiàn)報道。
　　 3.S基因的MHR區(qū)變異特點(diǎn)分析
　　 YMDD突變患者、ADV耐藥患者和無耐藥突變患者分別有128例(60.66％)、62例(75.61％)和211例(44.51％)具有MHR位點(diǎn)變異，三者在B基因型(P=0.001，X2=14.175)和C基因型(P=0.002，X2=12.274

18、)中的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。根據(jù)MHR區(qū)的氨基酸特點(diǎn)和功能，參照既往研究分析，發(fā)現(xiàn)MHR區(qū)的124-137位氨基酸區(qū)段，在B基因型中YMDD突變患者和ADV耐藥突變患者氨基酸突變個數(shù)明顯多于無耐藥突變患者(1.46Vs.2.56Vs.2.07，P＝0.037，X2=6.576)，而該差別在C基因型無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.57Vs.2.52Vs.2.52，P=0.993，X2=0.014)。而在C基因型患者，MHR的149-169位氨基酸突變數(shù)量

19、在YMDD突變患者中最高，無耐藥的患者最少，三組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(YMDD突變組Vs.ADV耐藥組Vs.無耐藥組=1.13Vs.0.84Vs.0.5，P=0.008，X2=9.546)。
　　 4.S基因終止密碼突變分析
　　 在YMDD突變患者檢測到8例具有S基因終止密碼子，分別有4例分布于B基因型和4例分布于C基因型，其突變類型有:sS53*、sS61*＋sC69*、sW74*、sW196*、sY100*＋sW19

20、6*、sY206*、sL216*，其中rtM204I所對應(yīng)的sW196*突變，僅發(fā)現(xiàn)2例(1.49％，2/134)。終止密碼子在B型和C型YMDD突變患者中的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 與既往研究類似，rtA181T突變可以導(dǎo)致sW172*突變，但并不是所有的rtA181T均導(dǎo)致該突變。在本研究中，ADV耐藥患者共有6種終止密碼突變類型，分別為:sW172*、sW172*＋sW199*、sW172*＋sC76*、sW172*＋sC

21、69*、sW172*＋sW182*、sY200*＋sW201*等。其中rtW172*最多，有25例，其次是sW172*＋sW199*和sW172*＋sW182*各有2例，其余突變類型均發(fā)現(xiàn)1例。該組患者S基因終止突變亦無B和C基因型分布差別。
　　 在經(jīng)核苷類藥物治療但是未出現(xiàn)耐藥的患者亦發(fā)現(xiàn)有8種終止密碼突變，分別為:sS53*1例，sS61*1例，sC69*2例，sC69*＋sW74*1例，sW182*4例，sW196*1例

22、，sW201*1例，sW216*1例。與前述sW196*突變是由于rtM204I所致不同，該組患者也具有sW196*突變，但是由rtD205N突變所致，該突變是否可以導(dǎo)致耐藥目前還不確定。
　　 結(jié)論:
　　 1.在該研究中發(fā)現(xiàn)2例可能為I基因型病例，其中1例已得到確認(rèn)。
　　 2.rtM204I＋rtL180M主要分布于C基因型，rtM204I＋rtL180M突變主要分布于B基因型，而rtM204V＋rtV17

23、3L＋rtL180M全部分布與C基因型。rtN236T主要分布于B基因型，而rtA181T在B和C基因型中的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
　　 3.rtM204I突變僅有少部分導(dǎo)致S基因出現(xiàn)sW196*突變，多數(shù)導(dǎo)致sW196L突變，部分導(dǎo)致sW196S突變。其中C基因型導(dǎo)致sW196L突變的比例多余B基因型，而B基因型中導(dǎo)致sW196S的比例多余C基因型。
　　 4.并非所有rtA181T突變均導(dǎo)致sW172*突變，有少數(shù)可以導(dǎo)