Notch信號(hào)途徑在Breg發(fā)育及變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答中的作用研究.pdf

1、免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)依賴于效應(yīng)性細(xì)胞和調(diào)節(jié)性細(xì)胞的平衡。與效應(yīng)T細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞已經(jīng)得到證實(shí),其存在及功能具有重要的意義。對(duì)于B細(xì)胞,一直認(rèn)為其通過產(chǎn)生抗體、提供共刺激分子、提呈抗原在免疫反應(yīng)中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用1,然而最近研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)中還存在發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞亞群——調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell,Breg)。
　　Breg是近年來確認(rèn)的一類具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞亞群,在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓

2、炎(EAE)2、炎癥性腸炎3、系統(tǒng)性紅斑狼瘡4、接觸性過敏反應(yīng)5、感染和腫瘤6等疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。部分Breg亞群的免疫調(diào)節(jié)功能依賴于IL-10,又被稱為B10細(xì)胞6,7。最近揭示了產(chǎn)生IL-10的Breg的表型,2008年Tedder等5研究發(fā)現(xiàn),在小鼠脾臟產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞大多數(shù)存在于CD5+CD1dhighCD19+B細(xì)胞亞群,這一亞群B細(xì)胞盡管只占野生型小鼠脾臟B細(xì)胞的很小一部分,但卻是產(chǎn)生IL-10的主要細(xì)胞1。C

3、D5+CD1dhighCD19+B10細(xì)胞的鑒定是Breg研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要進(jìn)展,為進(jìn)一步研究其起源、發(fā)育和功能特點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　Breg的發(fā)育和功能受多種信號(hào)途徑的調(diào)控,TLR信號(hào)、BCR信號(hào)、CD40信號(hào)均參與了Breg發(fā)育的調(diào)控,IL-21也是調(diào)控Breg細(xì)胞功能的重要分子。然而,但到目前為止,Breg發(fā)育的確切調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。
　　Notch信號(hào)途徑是調(diào)控細(xì)胞雙向亞群發(fā)育和雙向功能分化的重要信號(hào)途徑,不僅參

4、與T/B細(xì)胞分化、CD4/CD8T細(xì)胞分化等調(diào)控,還參與巨噬細(xì)胞的M1/M2極化、樹突狀細(xì)胞的致應(yīng)答/致耐受的調(diào)控等,但Notch信號(hào)途徑在Breg細(xì)胞發(fā)育及B細(xì)胞的正向/負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能中的作用及機(jī)制尚不明確。Notch信號(hào)通路包括Notch配體、Notch受體以及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和調(diào)節(jié)分子,Notch受體的激活需要轉(zhuǎn)錄因子RBP-J來介導(dǎo),將其敲除可以阻斷所有Notch受體的信號(hào),從而得到Notch受體完全失活的模型。我們課題組前期

5、研究發(fā)現(xiàn)RBP-J基因敲除小鼠的邊緣帶前體(T2-MZP)B細(xì)胞的數(shù)目減少,邊緣帶B(MZB)細(xì)胞數(shù)量也減少。結(jié)合最新研究認(rèn)為Breg細(xì)胞來源于T2-MZP細(xì)胞,我們推測(cè)Notch信號(hào)途徑在Bregs的發(fā)育和功能中可能也發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。
　　目的:本研究擬利用在B細(xì)胞特異性剔除Notch信號(hào)分子RBP-J基因的小鼠,分析Notch信號(hào)對(duì)Breg細(xì)胞發(fā)育影響,同時(shí)分析Notch信號(hào)途徑在B細(xì)胞特異性缺失后對(duì)接觸性超敏反應(yīng)和口服免

6、疫耐受應(yīng)答的影響。
　　方法:將CD19-Cre小鼠與RBP-flox小鼠交配,獲得CD19-Cre-RBP-Jf/f基因型的小鼠,流式細(xì)胞儀分析該小鼠CD19+CD5+CD1dhighBreg的數(shù)量和比例;分離上述小鼠脾臟細(xì)胞,體外給予不同刺激,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IL-10的B10細(xì)胞數(shù)目及B10前體細(xì)胞數(shù)目,分析Notch對(duì)B10細(xì)胞發(fā)育的影響。利用CD19-Cre-RBP-Jf/f小鼠和對(duì)照小鼠制備接觸性超敏反應(yīng)和口服免疫耐

7、受模型,分析Notch信號(hào)途徑在B細(xì)胞特異性缺失小鼠與對(duì)照小鼠相比在接觸性皮炎炎癥反應(yīng)和特異性IgE應(yīng)答等方面的差異。
　　結(jié)果:
　　(1)獲得了在B細(xì)胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠;與雜合小鼠相比,CD19-Cre-RBP-Jf/f小鼠脾臟CD19+CD5+CD1dhighBreg數(shù)量顯著降低;小鼠脾細(xì)胞體外刺激,細(xì)胞表面和胞漿內(nèi)抗體染色后,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示表達(dá)IL-10的B10及B10前體細(xì)胞的數(shù)目明顯少

8、于對(duì)照組。
　　(2)在接觸性超敏反應(yīng)模型中,B細(xì)胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠耳廓較雜合子小鼠厚度改變更為明顯,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色切片中顯示炎癥更顯著,即B細(xì)胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠接觸性超敏反應(yīng)更為嚴(yán)重。
　　(3)在口服免疫耐受模型中,CD19-Cre-RBP-Jf/f小鼠血清中IgE的水平較雜合子小鼠明顯升高,提示B細(xì)胞特異性敲除RBP-J基因的小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受