人胸腺和臍血造血干-祖細(xì)胞聯(lián)合移植對裸鼠T細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、背景與目的：胸腺是人體的中樞免疫器官,是T細(xì)胞分化成熟的場所。裸鼠是由于基因突變形成的先天無胸腺無毛小鼠,伴有嚴(yán)重T細(xì)胞缺乏和細(xì)胞免疫功能缺陷,因此裸鼠在人類腫瘤研究、免疫缺陷、抗感染免疫等方面的研究有較廣泛的應(yīng)用。有研究報道,在適當(dāng)?shù)臈l件下,將胸腺組織塊或培養(yǎng)的胸腺上皮細(xì)胞給免疫缺陷鼠移植,可以重建T細(xì)胞功能;也有研究表明,摘除胸腺的小鼠由于免疫功能發(fā)生缺陷,易形成腫瘤,經(jīng)移植胸腺后,抗腫瘤能力增強(qiáng)。其T細(xì)胞功能重建和抗腫瘤能力增強(qiáng)的

2、基礎(chǔ)必須是移植的胸腺在宿主體內(nèi)存活,并產(chǎn)生多種胸腺素和細(xì)胞因子,重建正常的胸腺環(huán)境,通過這些胸腺素和細(xì)胞因子促進(jìn)來自骨髓的淋巴干細(xì)胞分化成具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞,在胸腺發(fā)育成熟的T淋巴細(xì)胞到達(dá)外周免疫器官定居,通過免疫監(jiān)視功能防止腫瘤的發(fā)生,通過細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞。近年來,血液系統(tǒng)惡性腫瘤、嚴(yán)重的難治性自身免疫病、原發(fā)和繼發(fā)性免疫缺陷病等給人類健康造成極大威脅,重新建立和恢復(fù)正常的免疫功能是治愈這些疾病的重要環(huán)節(jié)和最終目標(biāo)。本研究

3、采用先天免疫缺陷的裸鼠為研究對象,通過移植人類胸腺組織建立人-鼠動物模型,再通過移植人臍血CD34+細(xì)胞,探討移植胸腺對CD34+細(xì)胞分化及裸鼠細(xì)胞免疫功能的影響。
　　 方法：
　　 1.胸腺組織移植至裸鼠腎被膜下將裸鼠麻醉,依次切開背部皮膚、肌肉、筋膜,暴露左側(cè)腎臟,將胸腺組織塊植入左腎包膜下,逐層縫合。SPF級分籠飼養(yǎng)60d。實驗結(jié)束時,解剖小鼠觀察移植的胸腺組織在小鼠腎臟存活情況,并經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測CD3分子、

4、HLA-DR分子在移植胸腺的表達(dá)情況。
　　 2.臍血單個核細(xì)胞分離和CD34+細(xì)胞分選取健康產(chǎn)婦自然分娩斷臍后的臍靜脈血,抗凝。經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液離心獲得臍血單個核細(xì)胞。免疫磁珠法分選出CD34+細(xì)胞。臺盼蘭染色計數(shù)活細(xì)胞(占95％以上)。流式細(xì)胞儀檢測CD34+占75％。
　　 3.裸鼠臍血CD34+細(xì)胞的移植實驗組在胸腺移植2周后,將新鮮分離的臍血CD34+細(xì)胞懸液經(jīng)小鼠靜脈輸入,每只小鼠輸入1×106/mL CD3

5、4+細(xì)胞0.3 mL,對照組不經(jīng)胸腺移植直接給予CD34+細(xì)胞移植,2組小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至60d。
　　 4.小鼠免疫功能的檢測2組小鼠飼養(yǎng)至60d,每組小鼠中10只進(jìn)行血液和外周免疫器官T細(xì)胞分布和數(shù)量觀察,另5只進(jìn)行人胃癌腫瘤細(xì)胞系BCG823移植,觀察腫瘤生長情況。
　　 5.裸鼠靜脈血中人源T細(xì)胞及其亞群百分比取小鼠眼底靜脈血0.5 mL,裂解紅細(xì)胞,PBS液洗3次,分別加入FITC-抗人CD3、FITC-抗人CD4

6、、FITC-抗人CD8單抗和PE-抗人CD25單抗,4℃,孵育30 min,PBS漂洗2次。以同種熒光標(biāo)記的同型抗體作對照。重懸細(xì)胞至200μL上流式細(xì)胞儀檢測。
　　 6.裸鼠脾臟中CD3+T細(xì)胞的分布處死小鼠,耿出脾臟,用體積分?jǐn)?shù)10％中性福爾馬林液固定,石蠟包埋,切片,HE染色。免疫組化染色操作按試劑盒(S-P法北京中杉公司提供)說明書,進(jìn)行CD3抗原檢測,使用DAB一步法顯色劑顯色。
　　 7.裸鼠對異種腫瘤細(xì)胞

7、的排斥反應(yīng)將常規(guī)傳代培養(yǎng)人胃癌BGC823細(xì)胞,制成1×107/mL,細(xì)胞濃度,每只小鼠右肩部皮下注射腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL,觀察腫瘤生長,記錄腫瘤大小。以腫瘤相互垂直的最大徑與2條最小徑的乘積(mm3)表示腫瘤大小。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,采用t檢驗,計數(shù)資料采用x2檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.人胸腺

8、在裸鼠腎被膜下存活及CD3、HLA-DR分子的表達(dá)胸腺移植60 d后,處死小鼠解剖可見移植的胸腺在腎被膜下存活,周圍無缺血、壞死和炎癥;HE染色和免疫組織化學(xué)染色可見腎和移植的胸腺組織結(jié)構(gòu)清晰,移植的胸腺組織彌漫表達(dá)CD3分子和HLA-DR分子。
　　 2.胸腺和CD34+細(xì)胞移植后裸鼠脾臟T細(xì)胞的分布胸腺與CD34+細(xì)胞聯(lián)合移植組小鼠脾臟可見點塊狀分布的CD3+細(xì)胞;單獨臍血CD34+細(xì)胞移植組未見CD3+細(xì)胞分布。
　

9、　 3.實驗組裸鼠靜脈血中人源T細(xì)胞及其亞群百分比胸腺和CD34+細(xì)胞聯(lián)合移植組CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞及CD4+CD25+細(xì)胞比例均顯著高于單獨CD34+臍血移植組和空白組。P＜0.054實驗組裸鼠對移植人胃癌BGC823細(xì)胞的排斥作用胸腺及臍血CD34+細(xì)胞聯(lián)合移植的實驗組,接種BGC823細(xì)胞后觀察15 d未見腫瘤生長,而單獨CD34+細(xì)胞移植的對照組在接種腫瘤細(xì)胞3 d后出現(xiàn)腫瘤塊,且逐漸生長、腫瘤塊增長迅速。