MOO誘導(dǎo)的Notch信號(hào)系統(tǒng)與PTEN在HUVEC中調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：我國(guó)每年死于冠心病人數(shù)達(dá)100多萬(wàn),缺血心肌的血管新生問題是目前心血管臨床急待解決的問題。導(dǎo)師組近年來致力于巴戟天糖鏈(morinda officinalis oligosaccharidcs,MOO)對(duì)缺血心肌的保護(hù)及血管新生作用研究。以往對(duì)MOO研究發(fā)現(xiàn):MOO可以顯著縮小心肌梗死面積,提高缺血心肌微血管密度,明顯的減輕缺氧復(fù)氧或缺血/再灌注對(duì)心肌的損傷,促進(jìn)雞胚絨毛尿囊血管生成,顯著誘導(dǎo)血管新生過程中VEGF蛋白、bFGF蛋

2、白、Flt-1蛋白及PDGF-B蛋白的表達(dá)。在巴戟天糖鏈的促血管新生的分子機(jī)制方面,導(dǎo)師組以缺氧復(fù)氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對(duì)象,證實(shí)了MOO可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖,遷移及促進(jìn)管腔形成。導(dǎo)師組基因芯片研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺血心肌中存在Notch信號(hào)通路和PTEN的參與,但其具體機(jī)制尚不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)采用HUVEC細(xì)胞為研究對(duì)象,探討Notch信號(hào)通路阻斷前后,對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響,及檢測(cè)MOO誘導(dǎo)下,對(duì)Notc

3、h信號(hào)通路各基因和PTEN的mRNA表達(dá)及蛋白變化,進(jìn)一步探討MOO在缺血心肌中的分子作用機(jī)制,及其誘導(dǎo)下Notch信號(hào)通路與PTEN的調(diào)控機(jī)制,為其在缺血心肌保護(hù)方面提供依據(jù)。
　　 方法：⑴建立內(nèi)皮細(xì)胞體外缺氧復(fù)氧損傷(H/R)模型:取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以適宜細(xì)胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶或相應(yīng)的孔板中,培養(yǎng)24h。棄去原有培養(yǎng)基,PBS洗2遍,缺氧液預(yù)先用高純氮?dú)怙柡?37℃缺氧1h;棄去缺氧

4、液,PBS洗2遍,加入復(fù)氧液,37℃復(fù)氧2h。模型后細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。⑵檢測(cè)HUVEC細(xì)胞中Notch1、JAG1、DLL4、HES1、PTEN和GAPDH基因表達(dá):收獲正常組和缺氧復(fù)氧組HUVEC細(xì)胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,Q-PCR檢測(cè)各基因表達(dá)量及相對(duì)變化。⑶MTT檢測(cè)DAPT對(duì)H/R HUVEC細(xì)胞增殖的影響:HUVEC單細(xì)胞懸液以1×104/cm2的濃度種于含有1、10、50μmol/L DAPT或含有0.1％(v/v

5、)DMSO的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的96孔板中,共4組,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞體外缺氧復(fù)氧損傷(H/R)模型后,繼續(xù)用含DAPT或DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后,采用MTT法檢測(cè)。⑷流式細(xì)胞儀檢測(cè)DAPT對(duì)H/R HUVEC的細(xì)胞周期影響:HUVEC單細(xì)胞懸液以2×105/瓶的細(xì)胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中,按上述方法造模給藥,72h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。⑸檢測(cè)各組Notch通路及PTEN的mRNA

6、相對(duì)變化:HUVEC單細(xì)胞懸液以5×106的細(xì)胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)24h。分為四組,正常組、模型組、MOO組、MOO組+DAPT組。建立缺氧復(fù)氧模型,進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)48h后,收獲細(xì)胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,采用ABI7500 Fast PCR儀,以GAPDH為內(nèi)參,依據(jù)2-△△Ct相對(duì)定量法測(cè)定mRNA變化。⑹Immunocytochemical檢測(cè)Notch1蛋白及PTEN蛋白:處理后的蓋玻片平鋪于六孔板中,以5

7、×105/孔的細(xì)胞密度接種,細(xì)胞鋪滿約80%左右,做缺氧復(fù)氧模型,分為五組給藥,分別為正常對(duì)照組,模型組,MOO組,MOO+DAPT組,陰性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48h后,做免疫細(xì)胞化學(xué),拍照,分析結(jié)果。⑺計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析,組間用LSD法進(jìn)行兩兩比較,取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：①Q(mào)-PCR檢測(cè)基因表達(dá)結(jié)果:HUVEC細(xì)胞中Not

8、ch1、JAG1、DLL4、HES1、PTEN基因均有表達(dá),缺氧復(fù)氧損傷后Notch1、JAG1、DLLA、HES1明顯上調(diào)(p＜0.05)。②MTT、FCM檢測(cè)結(jié)果顯示:10、50μmol/L的DAPT對(duì)HUVEC增殖有促進(jìn)作用(p＜0.05),低濃度1μmol/LDAPT促進(jìn)作用不明顯(p＞0.05)。1、10、50μmol/L DAPT對(duì)缺氧復(fù)氧HUVEC細(xì)胞周期沒有顯著影響(p＞0.05)。③Q-PCR檢測(cè)基因相對(duì)定量結(jié)果:Q-

9、PCR檢測(cè)mRNA表達(dá),與模型組相比,MOO組Notch1、DLL4、HES1基因mRNA低表達(dá)(p＜0.05),PTEN基因mRNA低表達(dá)(p＜0.05)。DAPT阻斷Notch通路后,PTEN mRNA表達(dá)量變化沒有顯著性差異。④Immunocytochemical結(jié)果:Immunocytochemical檢測(cè)Notch1和PTEN蛋白蛋白表達(dá),采用Biosens DigitalImaging System V1.6軟件,選取10個(gè)

10、視野,測(cè)定陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度值(Integrated Option Density,IOD)。與正常組相比,模型組Notch1蛋白黃棕色表達(dá)明顯升高,IOD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),PTEN蛋白黃棕色變化則不明顯,IOD值沒有明顯差異(p＞0.05)。與模型組相比,MOO組Notch1蛋白和PTEN蛋白黃棕色表達(dá)明顯降低,IOD值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),但DAPT阻斷Notch通路后,PTEN蛋白黃棕色表達(dá)則變化不明顯,