MOO誘導的Notch信號系統(tǒng)與PTEN在HUVEC中調控機制研究.pdf

1、目的：我國每年死于冠心病人數達100多萬,缺血心肌的血管新生問題是目前心血管臨床急待解決的問題。導師組近年來致力于巴戟天糖鏈(morinda officinalis oligosaccharidcs,MOO)對缺血心肌的保護及血管新生作用研究。以往對MOO研究發(fā)現(xiàn):MOO可以顯著縮小心肌梗死面積,提高缺血心肌微血管密度,明顯的減輕缺氧復氧或缺血/再灌注對心肌的損傷,促進雞胚絨毛尿囊血管生成,顯著誘導血管新生過程中VEGF蛋白、bFGF蛋

2、白、Flt-1蛋白及PDGF-B蛋白的表達。在巴戟天糖鏈的促血管新生的分子機制方面,導師組以缺氧復氧人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為研究對象,證實了MOO可以促進HUVEC細胞增殖,遷移及促進管腔形成。導師組基因芯片研究結果發(fā)現(xiàn),缺血心肌中存在Notch信號通路和PTEN的參與,但其具體機制尚不明確。因此,本實驗將繼續(xù)采用HUVEC細胞為研究對象,探討Notch信號通路阻斷前后,對細胞增殖和細胞周期的影響,及檢測MOO誘導下,對Notc

3、h信號通路各基因和PTEN的mRNA表達及蛋白變化,進一步探討MOO在缺血心肌中的分子作用機制,及其誘導下Notch信號通路與PTEN的調控機制,為其在缺血心肌保護方面提供依據。
　　 方法：⑴建立內皮細胞體外缺氧復氧損傷(H/R)模型:取第3代對數生長期的HUVEC細胞,制成單細胞懸液,以適宜細胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶或相應的孔板中,培養(yǎng)24h。棄去原有培養(yǎng)基,PBS洗2遍,缺氧液預先用高純氮氣飽和,37℃缺氧1h;棄去缺氧

4、液,PBS洗2遍,加入復氧液,37℃復氧2h。模型后細胞用于后續(xù)試驗。⑵檢測HUVEC細胞中Notch1、JAG1、DLL4、HES1、PTEN和GAPDH基因表達:收獲正常組和缺氧復氧組HUVEC細胞,提取總RNA,反轉錄cDNA,Q-PCR檢測各基因表達量及相對變化。⑶MTT檢測DAPT對H/R HUVEC細胞增殖的影響:HUVEC單細胞懸液以1×104/cm2的濃度種于含有1、10、50μmol/L DAPT或含有0.1％(v/v

5、)DMSO的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的96孔板中,共4組,每組設置6個復孔。培養(yǎng)24h后構建內皮細胞體外缺氧復氧損傷(H/R)模型后,繼續(xù)用含DAPT或DMSO培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后,采用MTT法檢測。⑷流式細胞儀檢測DAPT對H/R HUVEC的細胞周期影響:HUVEC單細胞懸液以2×105/瓶的細胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中,按上述方法造模給藥,72h后,流式細胞儀檢測細胞周期。⑸檢測各組Notch通路及PTEN的mRNA

6、相對變化:HUVEC單細胞懸液以5×106的細胞密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)24h。分為四組,正常組、模型組、MOO組、MOO組+DAPT組。建立缺氧復氧模型,進行無血清培養(yǎng)48h后,收獲細胞,提取總RNA,反轉錄cDNA,采用ABI7500 Fast PCR儀,以GAPDH為內參,依據2-△△Ct相對定量法測定mRNA變化。⑹Immunocytochemical檢測Notch1蛋白及PTEN蛋白:處理后的蓋玻片平鋪于六孔板中,以5

7、×105/孔的細胞密度接種,細胞鋪滿約80%左右,做缺氧復氧模型,分為五組給藥,分別為正常對照組,模型組,MOO組,MOO+DAPT組,陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48h后,做免疫細胞化學,拍照,分析結果。⑺計量資料數據采用均數±標準差(-x±s)表示,采用統(tǒng)計學軟件SPSS18.0進行方差齊性檢驗、單因素方差分析,組間用LSD法進行兩兩比較,取α=0.05作為檢驗水準。
　　 結果：①Q-PCR檢測基因表達結果:HUVEC細胞中Not

8、ch1、JAG1、DLL4、HES1、PTEN基因均有表達,缺氧復氧損傷后Notch1、JAG1、DLLA、HES1明顯上調(p＜0.05)。②MTT、FCM檢測結果顯示:10、50μmol/L的DAPT對HUVEC增殖有促進作用(p＜0.05),低濃度1μmol/LDAPT促進作用不明顯(p＞0.05)。1、10、50μmol/L DAPT對缺氧復氧HUVEC細胞周期沒有顯著影響(p＞0.05)。③Q-PCR檢測基因相對定量結果:Q-

9、PCR檢測mRNA表達,與模型組相比,MOO組Notch1、DLL4、HES1基因mRNA低表達(p＜0.05),PTEN基因mRNA低表達(p＜0.05)。DAPT阻斷Notch通路后,PTEN mRNA表達量變化沒有顯著性差異。④Immunocytochemical結果:Immunocytochemical檢測Notch1和PTEN蛋白蛋白表達,采用Biosens DigitalImaging System V1.6軟件,選取10個

10、視野,測定陽性區(qū)平均積分光密度值(Integrated Option Density,IOD)。與正常組相比,模型組Notch1蛋白黃棕色表達明顯升高,IOD值有統(tǒng)計學意義(p＜0.05),PTEN蛋白黃棕色變化則不明顯,IOD值沒有明顯差異(p＞0.05)。與模型組相比,MOO組Notch1蛋白和PTEN蛋白黃棕色表達明顯降低,IOD值均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05),但DAPT阻斷Notch通路后,PTEN蛋白黃棕色表達則變化不明顯,