Notch信號(hào)對(duì)天然免疫的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、Notch基因首次發(fā)現(xiàn)于1919年,其突變可造成果蠅翅膀邊緣的一些缺刻(Notchs)而得以命名。目前發(fā)現(xiàn),Notch受體在不同物種之間(從果蠅到人)以及同一物種的不同成員之間都有高度的結(jié)構(gòu)同源性。已知的Notch受體有4種,Notch1、Notch2、Notch3表達(dá)于多種組織器官,其中Notch1的表達(dá)更為廣泛。脊椎動(dòng)物Notch配體分為Delta-like與Jagged兩類,前者包括delta-like1,delta-like3和

2、delta-like4(又稱Delta1,Delta3,Delta4或Dll1,Dll3,Dll4),后者包括Jagged(Serrate)1和Jagged(Serrate)2。這些配體與相同或不同的Notch受體結(jié)合,激活Notch信號(hào)通路,參與調(diào)控許多器官、組織、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　 目前認(rèn)為,Notch信號(hào)途徑的活化主要采用“三步蛋白質(zhì)水解模式”。無(wú)活性的Notch前體從高爾基體中合成后,在向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中,經(jīng)不同蛋白

3、酶體的切割作用,釋放胞內(nèi)段NICD轉(zhuǎn)入核內(nèi)。NICD的RAM區(qū)可以結(jié)合DNA結(jié)合蛋白CSL,在Notch未活化的情況下,CSL蛋白常常作為轉(zhuǎn)錄抑制因子,與SMRT、SHARP、HDAC、CIR等蛋白組成共抑制復(fù)合物來(lái)抑制基因轉(zhuǎn)錄。Notch信號(hào)除了CSL依賴途徑外,Notch信號(hào)還有CSL非依賴途徑,這一途徑包含一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的鋅指蛋白Deltex。NICD與CSL結(jié)合后所產(chǎn)生的效應(yīng)是多樣的,CSL通過(guò)與不同的啟動(dòng)子結(jié)合可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活化或抑制

4、作用。由此可見(jiàn),Notch在調(diào)節(jié)基因的表達(dá)中可產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用。
　　 Notch信號(hào)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,Notch信號(hào)可關(guān)閉神經(jīng)原細(xì)胞bHLH基因的表達(dá)使外胚層細(xì)胞不能繼續(xù)向神經(jīng)細(xì)胞分化,阻止了神經(jīng)元的分化。Notch信號(hào)在腫瘤的形成、發(fā)展中也發(fā)揮著不同的作用:一方面,Notch可通過(guò)活化一些生長(zhǎng)信號(hào),促進(jìn)一些腫瘤的生長(zhǎng)。另一方面,目前也有很多研究發(fā)現(xiàn)Notch可通過(guò)抑制某些信號(hào)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。綜上所述,Notc

5、h信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化及凋亡中有重要作用,是許多重要細(xì)胞信號(hào)通路的交匯點(diǎn)。目前已經(jīng)有研究表明Notch信號(hào)在免疫細(xì)胞的分化和發(fā)育過(guò)程中也起決定性作用,但是,有關(guān)Notch信號(hào)與天然免疫的關(guān)系尚有待于深入研究。由此,我們提出的科學(xué)問(wèn)題是:Notch信號(hào)在天然免疫識(shí)別與活化中的調(diào)控作用是什么?
　　 對(duì)Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的深入研究是近幾年來(lái)免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,具有重

6、要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。TLR在識(shí)別PAMP中起重要作用,作為一種重要的模式識(shí)別受體,主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)表面,構(gòu)成機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線。大多數(shù)TLRs與特定的配體結(jié)合后,通過(guò)MyD88依賴途徑即MyD88/IRAK/TRAF6級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)活化MAPK和NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá),啟動(dòng)天然免疫。而TLR3和TLR4還存在著MyD88非依賴途徑,即通過(guò)接頭分子TR

7、IF或TRAM,最終引起NF-κB的晚期活化和IRF3的核轉(zhuǎn)位,調(diào)控炎性因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá)。TLR不僅啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答,控制炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間,而且調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型,成為連接初始免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的樞紐。TLR信號(hào)過(guò)度活化或活化不足都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體功能異常和疾病的發(fā)生,利用TLRs激動(dòng)劑可增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答,有利于機(jī)體清除入侵病原微生物。而負(fù)相調(diào)控TLR信號(hào)通路,可抑制TLRs誘發(fā)的過(guò)強(qiáng)免疫應(yīng)答,為感染性疾

8、病、腫瘤和自身免疫性疾病,以及TLRs介導(dǎo)的免疫紊亂疾病如內(nèi)毒素休克的防治提供新的思路。針對(duì)Notch信號(hào)在天然免疫識(shí)別與活化中的調(diào)控作用是什么的科學(xué)問(wèn)題,我們想知道Notch信號(hào)對(duì)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控究竟具有什么樣的影響?
　　 大量研究表明Notch信號(hào)可與其它信號(hào)途徑相互作用來(lái)調(diào)控免疫細(xì)胞的功能。Notch信號(hào)不但可調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞的分化,Notch信號(hào)可調(diào)控T細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、Il-10等細(xì)胞因子的分泌,調(diào)

9、節(jié)免疫應(yīng)答。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中,Notch受體、配體的表達(dá)模式具有時(shí)空性,這提示Notch信號(hào)可能參與了抗原遞呈細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Notch1受體可增強(qiáng)IFN-γ誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞STAT1依賴的轉(zhuǎn)錄,上調(diào)IFN-γ調(diào)控因子,抑制ICAM1和MHCII分子的表達(dá),繼而參與調(diào)控一些與抗原遞呈和殺傷相關(guān)基因的表達(dá)。最近有人發(fā)現(xiàn)TLR信號(hào)通路可上調(diào)巨噬細(xì)胞表面Notch1的表達(dá)

10、,影響Th1/Th2細(xì)胞的分化,調(diào)控免疫反應(yīng)； LPS刺激可上調(diào)Raw123細(xì)胞表面的Notch1表達(dá),增強(qiáng)Notch信號(hào)的活化。那么,作為可被TLR誘導(dǎo)增加的Notch1是否可反過(guò)來(lái)調(diào)控TLR信號(hào)通路來(lái)影響免疫應(yīng)答?如果可以,它又發(fā)揮著怎樣的調(diào)控作用?其具體的調(diào)控機(jī)制如何?對(duì)于這些科學(xué)問(wèn)題,未見(jiàn)研究報(bào)道。本課題針對(duì)Notch信號(hào)可能參與TLR信號(hào)觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生這一設(shè)想進(jìn)行研究,旨在探討Notch信號(hào)對(duì)TLRs觸發(fā)的炎性細(xì)胞因

11、子產(chǎn)生的影響及與TLRs信號(hào)通路的交互作用點(diǎn)。
　　 該課題主要分三部分進(jìn)行研究:TLRs觸發(fā)的巨噬細(xì)胞中Notch分子的表達(dá)情況；Notch分子對(duì)TLR信號(hào)誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響；Notch分子對(duì)巨噬細(xì)胞TLRs信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。
　　 1、TLRs觸發(fā)的巨噬細(xì)胞中Notch受體、配體表達(dá)的研究
　　 我們檢測(cè)了靜息的巨噬細(xì)胞(Raw264.7細(xì)胞及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)表面Notch受體及配體的表

12、達(dá)以及經(jīng)不同TLR配體(LPS,CpG ODN,poly I:C)刺激后,巨噬細(xì)胞中Notch1-4的表達(dá)變化。熒光定量PCR(Q-PCR)結(jié)果表明,Raw246.7和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均表達(dá)Notch1、Notch2和Notch14,而且Notch1的表達(dá)量最大,Notch2次之,Notch4最少,但不表達(dá)Notch3。在巨噬細(xì)胞中Notch的配體均有不同程度的表達(dá),其中,Dll4和Jagged1的表達(dá)豐度高,其他的配體次之。100ng

13、/ml LPS、0.33μMCpG和10 ng/ml poly I:C刺激可顯著上調(diào)Raw246.7細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞中Notch1和Notch2的表達(dá)。
　　 2、Notch信號(hào)對(duì)TLR信號(hào)誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響
　　 研究表明,過(guò)表達(dá)Notch1分子的胞內(nèi)區(qū)(NICD)與Notch1配體激活Notch1后對(duì)靶細(xì)胞的作用是一致的。鑒于此,我們將組成性活化形式的NICD1、NICD2以及NICD1的PEST

14、結(jié)構(gòu)域缺失的突變(N1-6MT)載體,轉(zhuǎn)染至原代腹腔巨噬細(xì)胞及Raw246.7細(xì)胞中,觀察Notch信號(hào)對(duì)TLR信號(hào)通路的影響。
　　 首先,在原代腹腔巨噬細(xì)胞中研究Notch信號(hào)對(duì)TLR信號(hào)通路的影響。我們分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,體外進(jìn)行培養(yǎng),觀察過(guò)表達(dá)組成性活化的NICD1、NICD2和N1-6MT,LPS刺激后細(xì)胞因子的分泌情況。ELISA的結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)NICD1和NICD2均可增強(qiáng)原代腹腔巨噬細(xì)胞IL-10的分泌,而下

15、調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌。說(shuō)明Notch信號(hào)活化抑制了炎性細(xì)胞因子的分泌,對(duì)TLR信號(hào)通路可能起負(fù)向調(diào)控作用。而過(guò)表達(dá)N1-6MT對(duì)以上細(xì)胞因子的分泌效應(yīng)具有相反的效果,說(shuō)明,NICD1的PEST結(jié)構(gòu)域?qū)ρ仔约?xì)胞因子分泌的抑制效應(yīng)是至關(guān)重要的。
　　 其次,在Raw246.7細(xì)胞中研究了Notch1對(duì)TLR信號(hào)通路誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。我們將組成性活化形式的NICD1和N1-6MT

16、載體,轉(zhuǎn)染至Raw246.7細(xì)胞中,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)ICN的細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株；觀察經(jīng)TLR配體刺激后Raw246.7-ICN和Raw246.7對(duì)照載體細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌(IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β)的變化。Q-PCR及ELISA的結(jié)果發(fā)現(xiàn):過(guò)表達(dá)NICD1可明顯增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的IL-10的分泌,而下調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌。而過(guò)表達(dá)N1—6MT,對(duì)以上細(xì)胞因

17、子的分泌效應(yīng)正好具有相反效果。
　　 進(jìn)而,在此基礎(chǔ)上,我們利用Notch信號(hào)的化學(xué)阻斷劑GSI處理Raw264.7細(xì)胞和小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,觀察不同TLRs配體刺激對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IL-10、IL-6、TNF-α)的變化。結(jié)果顯示:阻斷劑GSI處理巨噬細(xì)胞24h抑制了Notch信號(hào)后,再用LPS刺激,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-10的分泌減少,而IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌增加。這一結(jié)果說(shuō)明,Notch信號(hào)

18、被阻斷后,對(duì)TLR信號(hào)通路誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生被逆轉(zhuǎn),從反面證明了Notch信號(hào)活化對(duì)TLR信號(hào)引起的細(xì)胞因子的調(diào)控作用。
　　 另一方面,我們通過(guò)Notch1特異性干擾RNA,檢測(cè)Notch1表達(dá)的下調(diào)對(duì)LPS誘發(fā)的細(xì)胞因子分泌的影響。我們首先用Q-PCR及Western Blot檢測(cè)了其特異性干擾RNA的干擾效率,在Notch1特異性干擾RNA的干擾效率達(dá)70％以上時(shí),在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,干擾Notch1的表達(dá)可下調(diào)LP

19、S誘發(fā)的IL-10的分泌,而上調(diào)了IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌。這一結(jié)果,與化學(xué)阻斷劑GSI的作用效果相一致。
　　 因此,在該部分試驗(yàn)中,無(wú)論是Notch1信號(hào)的活化還是不同方法進(jìn)行的Notch1信號(hào)的阻斷,在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中均得到一致的結(jié)果。這說(shuō)明Notch1信號(hào)確實(shí)參與了LPS誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　 3、Notch對(duì)巨噬細(xì)胞TLRs信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制
　

20、　 首先,對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果顯示,在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NICD1可明顯降低LPS誘導(dǎo)的磷酸化ERK1/2的活化及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,而過(guò)表達(dá)N1-6MT,可明顯增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的磷酸化ERK1/2的活化及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。
　　 我們進(jìn)一步研究了GSI抑制劑及Notch1特異性干擾RNA在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中Notch1信號(hào)對(duì)LPS誘發(fā)的信號(hào)通路的影

21、響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),GSI抑制劑和Notch1特異性干擾RNA抑制Notch信號(hào)后,LPS促發(fā)的ERK1/2的磷酸化明顯增強(qiáng)。
　　 此外,我們還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)N1-6MT質(zhì)粒后,Notch信號(hào)失活,抑制IKBα的表達(dá),增強(qiáng)IKBα的磷酸化水平,提示Notch信號(hào)活化可抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 既然,在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中均能觀察到Notch信號(hào)對(duì)LPS促發(fā)的ERK1/2的磷酸化明顯變化,于是我們用MA

22、PKK抑制劑,即MAPK kinase抑制劑或MEK抑制劑——PD98059(可以選擇性抑制MEK1,從而抑制ERK1/2的磷酸化和激活),來(lái)觀察阻斷p44/42 MAPK的磷酸化后細(xì)胞因子的分泌影響。ELISA的結(jié)果表明,PD98059可明顯下調(diào)由Notch1信號(hào)活化所造成的細(xì)胞因子的變化。因此,我們認(rèn)為Notch1可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)途徑來(lái)參與TLRs信號(hào)的調(diào)控。
　　 其次,我們用熒光素酶報(bào)告基因分析來(lái)研究Notch和

23、NF-κB通路以及和TNF-α之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)NICD1、NICD2可以顯著降低由MyD88和TRAF6活化所引起的NF-κB以及TNF-α報(bào)告基因的活性。該結(jié)果說(shuō)明,過(guò)表達(dá)NICD1、NICD2可以抑制NF-κB和TNF-α的轉(zhuǎn)錄活性,而過(guò)表達(dá)N1-6MT,可以逆轉(zhuǎn)由NICD1對(duì)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用,說(shuō)明NICD1的PEST結(jié)構(gòu)域?qū)F-κB的轉(zhuǎn)錄活性以及TNF-α的分泌起到至關(guān)重要的抑制作用。
　　 最

24、后,我們利用免疫共沉淀方法尋找能與Notch1胞內(nèi)段結(jié)合的信號(hào)蛋白。在上述的研究中發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)可調(diào)控TLRs信號(hào)誘發(fā)的細(xì)胞因子的變化,在信號(hào)通路方面,Notch可降低LPS促發(fā)的ERK1/2信號(hào)的活化,那么Notch信號(hào)是怎樣調(diào)控ERK1/2信號(hào)通路的呢?它們之間是否有直接的相互作用呢?于是我們利用免疫共沉淀方法尋找能與Notch1胞內(nèi)段結(jié)合的信號(hào)蛋白。我們利用免疫沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在Notch1的免疫沉淀物中檢測(cè)不到ERK1/2,因

25、此,我們認(rèn)為Notch1與TLR信號(hào)的交互作用分子并非ERK1/2,可能直接或間接作用于其他靶分子調(diào)控了TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌。因此,我們認(rèn)為Notch1并不是直接作用于ERK分子,可能通過(guò)其它分子起間接作用。
　　 綜上所述,我們的研究表明,Notch1和Notch2分子參與巨噬細(xì)胞中TLR觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控,其通過(guò)ERK1/2和/或NF-κB途徑發(fā)揮了調(diào)控作用。其可能的因?yàn)橛袃煞N:1、Notch分別通過(guò)ERK1

26、/2和NF-κB兩條通路參與調(diào)控TLR觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子；2、ERK1/2和NF—κB信號(hào)在Notch調(diào)控TLRs的信號(hào)通路中,存在先后,這將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行證實(shí)。
　　 另外,對(duì)于本文的研究還存在一些需要進(jìn)一步探討的問(wèn)題:1、Notch分子通過(guò)不同的信號(hào)通路,抑制了炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等的分泌,而促進(jìn)了IL-10的分泌；2、Notch分子先促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌,IL-10又進(jìn)

27、一步抑制了IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等促炎細(xì)胞因子的分泌。關(guān)于這一假設(shè),其具體的靶點(diǎn)還未有充分的證據(jù),機(jī)制尚不明確,可以用IL-10的阻斷性抗體進(jìn)行后續(xù)的深入的研究。
　　 總之,這一調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn),有助于深入闡明Notch信號(hào)途徑在TLR信號(hào)途徑中的作用,并可能為探明不同信號(hào)途徑的相互作用在抗感染免疫中的作用提出新證據(jù),該課題豐富了TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制,將為感染、腫瘤等疾病的免疫學(xué)機(jī)理探究以及潛在的新型治