Notch信號系統(tǒng)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用研究.pdf

1、背景:隨著當(dāng)今社會的發(fā)展，冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）相關(guān)的發(fā)生率和致死率較以往明顯升高，其中以急性心肌梗死以及心功能不全為重要的死因。由于心肌細(xì)胞為不可再生細(xì)胞，心肌梗死后壞死細(xì)胞由纖維組織增生和瘢痕修復(fù)取代，梗死部位失去正常心肌收縮和傳導(dǎo)能力，導(dǎo)致心臟肌細(xì)胞重構(gòu)和心臟功能不全，鄰近梗死區(qū)的心肌細(xì)胞由于缺血缺氧成為冬眠心肌。傳統(tǒng)心肌梗死的治療方案包括藥物治療、介入治療和外科冠脈旁路移植手術(shù),在一定程度上挽救了缺血心肌、改善心?；?/p>

2、者預(yù)后，但不能使已梗死心肌細(xì)胞重生。特別是部分彌漫性血管病變及微小血管病變患者，介入和外科治療效果較差，支架植入后需長期口服抗血小板藥物，外科搭橋后的橋血管也可能再次粥樣硬化甚至閉塞。
　　近年來組織工程和再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)展為心肌梗死的治療和康復(fù)提供了新的希望，通過細(xì)胞移植的方法促進(jìn)血管新生、挽救缺血心肌、冬眠心肌成為缺血相關(guān)心臟疾病新的方向，這種新的治療理念和思路也被稱為“治療性血管生成”。在有關(guān)細(xì)胞移植及再生治療的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究

3、中用到過許多種類細(xì)胞，其中包括臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、胚胎來源的干細(xì)胞、間充質(zhì)多能干細(xì)胞等。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一類來源骨髓的，不同于造血干細(xì)胞的成體干細(xì)胞，具有自我不斷更新的能力和向多方向和譜系分化的潛能，在體外合適的條件誘導(dǎo)后，可向多種細(xì)胞類型發(fā)生分化。而且可以自體移植，易于將外源性的基因片段導(dǎo)入，因此成為熱點(diǎn)的種子細(xì)胞候選對象。BMSCs在移植后發(fā)揮治療性血管生成作用，主要?dú)w因于其向內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞分化、旁分

4、泌作用促進(jìn)血管新生，免疫調(diào)節(jié)作用控制梗死后炎癥等。
　　BMSCs向內(nèi)皮樣細(xì)胞發(fā)生分化的過程受多種因素調(diào)節(jié)，目前其具體機(jī)制仍有待深入探尋。Notch信號通道是一種在各物種、各細(xì)胞中廣泛存在的高度保守信號途徑，主要通過細(xì)胞相互直接接觸的形式傳導(dǎo)，在決定細(xì)胞分化方向及命運(yùn)方面起重要的調(diào)控作用。在心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育中Notch信號系統(tǒng)也起重要作用，它的異常激活或缺失都會導(dǎo)致心血管發(fā)育異常甚至是機(jī)體死亡。Notch信號通路在內(nèi)皮血管細(xì)胞

5、分化及動靜脈選擇、缺血誘導(dǎo)的新生血管形成中也扮演關(guān)鍵角色。本課題主要研究了人BMSCs在體外培養(yǎng)中向內(nèi)皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的可行性及Notch信號在BMSCs向內(nèi)皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的作用和相關(guān)的機(jī)制，以便為更好地改進(jìn)和發(fā)展 BMSCs移植治療缺血導(dǎo)致的心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)和理論的依據(jù)。
　　第一部分人BMSCs體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化
　　目的：體外培養(yǎng)人BMSCs，并用內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化，觀察其細(xì)胞形態(tài)、成血管能力

6、、細(xì)胞表面標(biāo)志物改變，明確BMSCs的內(nèi)皮分化潛能。
　　方法：
　　（1）體外貼壁培養(yǎng)人BMSCs原代細(xì)胞，增殖傳代至第三代（P3）作為研究對象，采用VEGFA165和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)人BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后細(xì)胞間的形態(tài)改變。
　?。?）通過免疫組織細(xì)胞化學(xué)法，檢測誘導(dǎo)分化過程中各組細(xì)胞表面內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物 Flk-1、vWF的表達(dá)情況：實(shí)驗(yàn)中各分組為對照組和誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組經(jīng)過內(nèi)皮誘

7、導(dǎo)液處理10天后取樣做免疫組織化學(xué)檢測，將誘導(dǎo)前后細(xì)胞接種在基底膜基質(zhì)（matrigel）上觀察其血管形成能力，ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白能力。
　?。?）采用蛋白免疫印跡法，觀察誘導(dǎo)前后人BMSCs上Notch配體DLL4表達(dá)情況，明確DLL4參與BMSCs向內(nèi)皮分化過程中。
　　結(jié)果：
　?。?）人類 BMSCs誘導(dǎo)前顯微鏡下形態(tài)為：細(xì)長梭狀、紡錘形，經(jīng) VEGFA165和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)后，部分

8、細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄?、多角、短梭狀?br>　?。?）人BMSCs在培養(yǎng)基中由VEGFA165和bFGF聯(lián)合處理10d后，免疫組化鑒定表明細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物Flk-1和vWF。誘導(dǎo)后細(xì)胞接種到 matrigel后，具備形成毛細(xì)血管網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)能力，并具有吞噬Ac-LDL能力。
　?。?）人BMSCs在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液中處理10d后，DLL4的蛋白表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯升高。
　　結(jié)論：
　　1、聯(lián)合VEGF和bFGF誘導(dǎo)

9、人BMSCs第三代細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的方案是可行的，誘導(dǎo)的最佳濃度:50ng/mlVEGF+10ngbFGF。分化后細(xì)胞從形態(tài)和部分功能上與內(nèi)皮細(xì)胞相似。
　　2、誘導(dǎo)人BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程中，細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)皮相關(guān)細(xì)胞標(biāo)志物隨著誘導(dǎo)時間逐漸增加，具備了體外成血管能力和攝取ac-LDL的能力。
　　3、誘導(dǎo)分化處理中，Notch信號的配體DLL4表達(dá)上調(diào)。
　　第二部分DLL4干擾質(zhì)粒和過表達(dá)病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染hB

10、MSCs
　　目的：采用基因載體技術(shù)，將合成的DLL4干擾序列和DLL4 homo序列分別用質(zhì)粒和慢病毒載體攜帶，轉(zhuǎn)染hBMSCs，構(gòu)建DLL4表達(dá)干預(yù)模型，為后續(xù)研究Notch信號通路在MSCs內(nèi)皮分化中的作用打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法克隆得到目的基因片段，然后與骨架載體質(zhì)粒分別雙酶切，將酶切后的PCR產(chǎn)物與剪切后呈線性化的載體連接，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過篩選陽性菌落，抽取質(zhì)粒，獲

11、得重組后攜帶目的基因的質(zhì)粒載體。
　　2、采用混合寡核苷酸（oligomix）的方法，分別合成DLL4的兩個片段，采用無縫克隆試劑盒連接，在載體LV5中完成重組，感受態(tài)細(xì)胞中篩選陽性菌落，抽取質(zhì)粒酶切鑒定，然后進(jìn)行慢病毒包裝、純化，最后感染hBMSCs。
　　3、用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DLL4干擾質(zhì)粒和過表達(dá)慢病毒的效果。
　　結(jié)果：DLL4干擾質(zhì)粒和過表達(dá)慢病毒均可轉(zhuǎn)入 hBMSCs，且分別下調(diào)和增高 DLL4的表達(dá)

12、r>　　結(jié)論：DLL4干擾和過表達(dá)載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染hBMSCs并干預(yù)DLL4的表達(dá)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　第三部分Notch信號系統(tǒng)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響
　　目的：通過基因修飾技術(shù)，調(diào)高和降低 DLL4在人 BMSCs中的表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染干擾和過表達(dá)質(zhì)粒后 BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化能力改變，明確 Notch信號通道的相關(guān)下游因子在誘導(dǎo)過程中的改變，研究干預(yù)Notch信號的表達(dá)和激活對誘導(dǎo)之后細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞

13、特征的影響，以便提高誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力、遷移能力、促血管生成能力，更好促進(jìn)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的臨床應(yīng)用。
　　方法：
　　1、VEGF聯(lián)合bFGF誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了DLL4干擾質(zhì)粒和DLL4過表達(dá)慢病毒的人BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，免疫組織化學(xué)染色檢測誘導(dǎo)細(xì)胞Flk-1和vWF表達(dá)。
　　2、WB檢測誘導(dǎo)分化過程中Notch信號通路下游分子Notch胞內(nèi)片段（NICD）、Hes1、Hes5及內(nèi)皮標(biāo)志物Flk-1、

14、vWF的表達(dá)，并用Notch1特異性阻斷劑DAPT處理誘導(dǎo)中的人BMSCs，觀察內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平及細(xì)胞成血管能力，吞噬Ac-LDL能力變化。
　　結(jié)果：
　　1、轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的hBMSC免疫組化染色Flk-1和vWF染色強(qiáng)度為弱陽性，過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染hBMSC免疫組化Flk-1和vWF中度陽性。
　　2、與普通誘導(dǎo)組相比，DLL4過表達(dá)hBMSC分化后表達(dá)NICD、Hes1、Hes5、Flk-1、vWF增加，

15、DLL4干擾hBMSC分化后表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物及下游基因表達(dá)下降，阻斷Notch信號減少誘導(dǎo)處理后細(xì)胞表面內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物及Notch下游基因表達(dá)。
　　3、與普通誘導(dǎo)組相比，DLL4過表達(dá) hBMSC誘導(dǎo)分化后體外成血管能力增強(qiáng)， DLL4干擾 hBMSC誘導(dǎo)后體外成血管能力和吞噬 ac-LDL能力減弱，誘導(dǎo)晚期加入DAPT促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞在膠體基質(zhì)上形成血管網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)的能力。
　　結(jié)論：DLL4-Notch信號通路激活在VEGF+b

16、FGF誘導(dǎo)hBMSC內(nèi)皮方向分化過程中起促進(jìn)作用，在誘導(dǎo)晚期阻斷Notch受體后，分化后細(xì)胞在體外血管形成實(shí)驗(yàn)中生成更多血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　第四部分卡諾醇對抗氧化應(yīng)激促進(jìn)大鼠骨髓多能成體祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　目的:了解抗氧化劑卡諾醇保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞對抗氧化壓力并促進(jìn)內(nèi)皮樣分化的作用和機(jī)制，為抗氧化劑和Noch信號通路聯(lián)合誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?）大鼠MAPCs的培養(yǎng)及H2O2和卡諾

17、醇對細(xì)胞增殖和活力的影響，MTT法檢測細(xì)胞活性；
　?。?）VEGF誘導(dǎo)大鼠MAPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，分別在卡諾醇預(yù)處理和未處理組里加入H2O2，檢測活性氧簇水平ROS生成和細(xì)胞凋亡酶3活性；
　?。?）蛋白印跡法檢測誘導(dǎo)10d后的細(xì)胞內(nèi)皮標(biāo)志物及Nrf-2表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）H2O2對大鼠MAPCs的細(xì)胞增殖能力和活性產(chǎn)生抑制，MTT分析細(xì)胞呈濃度依賴性死亡，在27 um/L濃度達(dá)到50％死亡，卡諾醇

18、預(yù)處理能呈劑量依賴提高細(xì)胞存活，濃度在0.2um/L時保護(hù)最強(qiáng)；
　?。?）在MAPCs向內(nèi)皮誘導(dǎo)分化過程中，H2O2明顯增加了細(xì)胞的ROS水平、細(xì)胞凋亡酶3活性以及細(xì)胞凋亡率，而卡諾醇預(yù)處理可對抗這些作用；
　?。?）檢測誘導(dǎo)分化10天后的細(xì)胞內(nèi)皮標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)H2O2處理組與對照組相比， OCT-4, Flk-1, CD31表達(dá)明顯下調(diào)。但是卡諾醇預(yù)處理后的H2O2處理組細(xì)胞內(nèi)皮標(biāo)志物上調(diào)，H2O2處理組與對照組相比Nrf-