尿毒癥血清對阿托伐他汀在Caco-2細胞模型中轉運的影響.pdf

1、目的:
　　慢性腎臟病(Chronic kidney Disease，CKD)可以影響主要經(jīng)腎臟排泄的藥物的清除，慢性腎臟病患者在應用此類藥物時，需調(diào)整劑量。但是CKD對主要經(jīng)過肝臟代謝或膽汁排泄的藥物的體內(nèi)過程的影響研究很少。研究表明，CKD患者體內(nèi)蓄積的尿毒癥毒素，在加速腎功能惡化，損害細胞和基質(zhì)蛋白的同時，還可以改變藥物的體內(nèi)過程。研究已經(jīng)證明，尿毒癥血清可以影響腸道轉運體的mRNA和蛋白的表達，但是目前尚無尿毒癥血清對藥物

2、經(jīng)腸道轉運體轉運影響的研究。阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)是慢性腎臟病患者常使用的藥物之一，在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝、膽汁排泄，僅2％經(jīng)腎臟排泄。研究表明，在腸道轉運模型-Caco-2細胞模型中單羧酸轉運體-1(Monocarboxylate transporter, MCT1)和P-糖蛋白(P-glycorprotein，P-gp)轉運體介導阿托伐他汀的吸收和外排。因此本課題利用Caco-2細胞模型，考察尿毒癥血清對阿托伐

3、他汀在小腸上皮細胞中轉運的影響，對MCT1介導阿托伐他汀吸收的影響和對P-gp介導阿托伐他汀外排的影響，探討阿托伐他汀在慢性腎衰竭患者腸道的吸收情況，為其臨床應用提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.Caco-2細胞模型的建立和驗證
　　將對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種到Transwell24孔板上培養(yǎng)21天，建立Caco-2單細胞層模型，以P-糖蛋白的陽性底物地高辛為探針藥物，并通過測定地高辛的表觀通透系數(shù)驗證

4、模型建立成功，同時利用電子顯微鏡掃描Caco-2細胞單層來觀察細胞形態(tài)學，并利用電阻儀測定單層膜的跨膜電阻值，考察Caco-2單細胞層模型的致密性和完整性。
　　2.驗證ATV在Caco-2細胞模型中的轉運情況
　　采用Caco-2單細胞層模型，通過測定阿托伐他汀自膜的基底面(Basolateralside，BL)側向絨毛面(Apical side，AP)側及AP側向BL側轉運時的表觀通透系數(shù)(apparent permea

5、bility，Papp)并計算其外排系數(shù)Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)，考察阿托伐他汀在Caco-2單細胞層模型中的轉運情況。
　　1.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)P-gp外排時的影響
　　采用Caco-2單細胞層模型，以空白血清為對照，通過比較在40、80、120min時，尿毒癥血清組與空白血清組及P-gp抑制劑GG918組的表觀滲透系數(shù)，考察尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排的影響。

6、　　2.尿毒癥血清對阿托伐他汀在Caco-2細胞模型中經(jīng)MCT1吸收時的影響
　　采用Caco-2單細胞層模型，以空白血清為對照，通過比較在40、80、120min時，尿毒癥血清組與空白血清組及MCT1抑制劑苯甲酸組的表觀滲透系數(shù)，考察尿毒癥血清對ATV經(jīng)MCT1吸收的影響。
　　結果:
　　1.Caco-2細胞模型的建立
　　經(jīng)過21天的培養(yǎng)周期，Caco-2細胞分化完全、形成緊密連接。選擇通過細胞位儀測定的跨

7、膜電阻值TEER大于400Ω·cm2的單層膜用于轉運試驗;隨著時間的增長，地高辛的跨膜轉運量逐漸增加，且120min時地高辛的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)為11.3±0.7×106cm·s-1, Papp(AP→BL)為3.41±1.4×106cm·s-1，外排系數(shù)Papp(BL→ AP)/Papp(AP→BL)為3.31，表明其外排方向(BL→AP)占轉運的主導地位，與文獻報道相符，說明Caco-2細胞模型中P-gp表達水平高，

8、該模型可用于轉運試驗。
　　2.ATV在Caco-2細胞模型中的轉運考察
　　在符合條件的Caco-2細胞單層膜中，隨著時間的增長，ATV的跨膜轉運量逐漸增加，在80、120min時ATV的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)和Papp(AP→BL)存在顯著性差異，且120min時Papp(BL→AP)為39.5±9.4×106cm·s-1，Papp(AP→BL)為2.55±0.8×106cm·s。1，外排系數(shù)Papp(BL→

9、AP)/Papp(AP→ BL)為15.4，表明其外排方向(BL→AP)占轉運的主導地位，與文獻中ATV的表觀滲透系數(shù)值接近。
　　3.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)P-gp外排時的影響
　　ATV在空白血清、尿毒癥血清及P-gp抑制劑GG918的抑制劑組中經(jīng)P-gp外排時，在120min內(nèi)，P-gp的抑制劑GG918和尿毒癥血清抑制ATV的外排，與正常血清組相比，上述兩組ATV的Papp(BL→AP)值均降低

10、，并且在80min和120min時，尿毒癥血清ATV的Papp(BL→AP)顯著降低(p＜0.01，p＜0.05);另外，與抑制劑組相比，40、80、120min時尿毒癥血清組ATV的Papp(BL→AP)均降低，且在120min存在顯著性差異(p＜0.05)。
　　4.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)MCT1吸收時的影響
　　ATV在空白血清、尿毒癥血清及MCT1抑制劑苯甲酸的抑制劑組中經(jīng)MCT1吸收時，在12

11、0min內(nèi)，與正常血清組相比，加入競爭性抑制ATV經(jīng)MCT1吸收的苯甲酸抑制劑組ATV的Papp(AP→BL)值降低，說明抑制劑苯甲酸抑制ATV的吸收。同時，與正常血清組相比，尿毒癥血清也抑制其吸收，在40、80、120min時，該組ATV的Papp(AP→BL)顯著降低(p＜0.05、p＜0.05、p＜0.01);并且尿毒癥血清組Papp(AP→BL)值均小于抑制劑組，且在120min時存在顯著性差異(p＜0.05)。
　　結論

12、:
　　1.本實驗通過將對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種到Transwell24孔板上，經(jīng)過21天的培養(yǎng)周期，以P-糖蛋白的陽性底物地高辛為探針藥物，通過測定地高辛的表觀通透系數(shù)驗證模型建立成功，同時利用電子顯微鏡掃描Caco-2單細胞層觀察Caco-2細胞分化完全、形成緊密連接，選擇單層膜電阻＞400Ω·cm2的單層膜用于轉運實驗。本實驗中地高辛和待測化合物ATV在Caco-2單細胞層模型中的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)值

13、及Papp(AP→BL)值和文獻中報道中的數(shù)據(jù)接近，說明本實驗建立的Caco-2單細胞層模型穩(wěn)定可靠。
　　2.在Caco-2細胞模型中，尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排和經(jīng)MCT1吸收的過程均具有抑制作用。提示:慢性腎功能衰竭患者的血清中可能含有可以抑制分別介導ATV外排和吸收的P-gp和MCT1活性的因子，從而影響ATV在腸道的吸收過程。此外，根據(jù)本實驗研究結果推測，尿毒癥血清可能同時影響腸道上皮細胞中介導阿托伐他汀吸收和外排