PARP抑制劑在阿霉素誘導的多發(fā)性骨髓瘤細胞自噬發(fā)生中的功能研究.pdf

1、研究背景和目的：自噬（autophagy）是蛋白降解的一種動態(tài)過程，在營養(yǎng)匱乏時可有典型出現(xiàn)。自噬作為一種溶酶體依賴的降解路徑,經(jīng)常在放療或化療的腫瘤細胞中發(fā)生，但其在腫瘤細胞中是保護細胞還是促進細胞死亡尚存爭議。大量研究表明，藥理或遺傳機制上抑制自噬，不同類型細胞可產(chǎn)生不同結果。多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)的高蛋白合成與分泌活性使其與蛋白降解的主要方式—自噬（autophagy），有著千絲萬縷的聯(lián)系。本實驗室研

2、究已證實阿霉素在骨髓瘤細胞中產(chǎn)生的自噬對骨髓瘤細胞具有保護作用。聚（ADP-核糖）聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是蛋白質翻譯后的修飾酶，在DNA損傷斷裂時，其聚ADP核糖基化作用可催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide-adeninedinucleotide,NAD+）裂解為二磷酸腺苷核糖（ADP-ribose）和尼克酰胺，并將二磷酸腺苷核糖轉移至受體蛋白谷氨酸殘基上形成聚二磷酸腺

3、苷核糖聚合物[poly(ADPribose),PAR]。PAR也能通過電荷排斥作用，防止附近的DNA分子與受損的DNA進行重組，并能引導DNA修復酶與缺口接觸，進行修復。每合成1molPAR，需要消耗1molNAD+和4當量ATP，因此，當PARP的反復活化過度時，將會引起細胞內NAD+和ATP的水平下降。PARP被證實參與不同的細胞死亡路徑，抑制它可在腫瘤細胞中產(chǎn)生不同效應。那么抑制PARP對阿霉素（doxorubicin，DOXO）

4、誘導的骨髓瘤細胞自噬及其死亡會有什么樣的作用呢?它們之間又有什么具體的聯(lián)系呢?本課題以多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)細胞系NCI-H929（H929）為實驗對象,探討PARP抑制劑ANI(4-amino-1,8-naphthalimide)對阿霉素誘導的多發(fā)性骨髓瘤細胞自噬的作用及其可能的分子機制，從而進一步為多發(fā)性骨髓瘤的新治療方法提供思路。
　　方法和結果：1、阿霉素（doxorubicin）引起MM細胞

5、凋亡：MTT實驗顯示，分別采用0.3125,0.625,1.25,2.5,5umol/l阿霉素處理H929細胞24h，各處理組活細胞百分比下降且呈濃度依賴性，提示阿霉素（doxorubicin）能夠有效誘導多發(fā)性骨髓瘤MM細胞死亡。臺盼藍排斥試驗顯示，以此H929細胞IC50值（2.2umol/l）處理細胞24h，相對未處理組活細胞百分比為85.5％。Caspase抑制劑zVAD.fmk（10umol/l預孵育2h，MM細胞非抑制濃度）

6、可顯著抑制阿霉素誘導的H929細胞死亡(P<0.05)；2、聚ADP核糖基化作用被激活:①DOXO2.2umol/l分別孵育H929細胞0,0.5,1,2,5h,westernblot顯示：細胞內PAR呈時間依賴性上升，2h達到高峰，5h顯示為下降；②2.2umol/l阿霉素處理H929細胞不同時間（0,15,30,45,60min），細胞內ATP相對未處理組分別百分比為95±0.35％,57±0.56％,56±0.16％,51±1.2

7、％，均顯著低未處理組（P＜0.05）；3、阿霉素作用骨髓瘤細胞誘導自噬，ATP上升保護細胞:①DOXO2.2umol/l處理H929細胞0,1,6,12,24h,westernblot檢測靶細胞中自噬相關蛋白LC3-II的表達呈時間依賴性顯著增加；②2.2umol/l阿霉素處理H929細胞24h，檢測細胞內ATP水平，相對未處理組百分比為233％；3MA10mM抑制自噬，ATP水平下降，細胞死亡率增加；4、ANI,寡霉素（Oligomy

8、cin）,丙酮酸甲酯(methylpyruvate，MP)分別與阿霉素聯(lián)用，對骨髓瘤細胞自噬、ATP及存活率的影響：ANI（10umol/l預孵育1h）聯(lián)合DOXO，Oligomycin1umol/l預孵育1h聯(lián)合用藥，MP1mmol/l預孵育8h聯(lián)合DOXO處理H929。①MTT顯示:ANI聯(lián)合DOXO對H929細胞可產(chǎn)生增敏作用，與DOXO單藥作用相比差異顯著（P<0.05)；Oligomycin1umol/l預孵育1h聯(lián)合用藥，促

9、進細胞對阿霉素的敏感性（P<0.05）。臺盼藍排斥實驗：MP聯(lián)合用藥較DOXO單處理組，活細胞百分比上升，差異顯著(P<0.05)；②ATP生物發(fā)光檢測證實：PARP抑制劑ANI、能量抑制劑Oligomycin、自噬抑制劑3MA、caspase抑制劑zVAD.fmk可顯著降低阿霉素誘導的細胞內ATP水平（P<0.05）；MP聯(lián)用阿霉素與單用阿霉素組相比，細胞內ATP水平無顯著差異（P>0.05）；③Westernblot顯示PARP抑制

10、劑ANI聯(lián)合阿霉素處理NCI-H929細胞，靶細胞中自噬相關蛋白LC3-II的表達下降；能量抑制劑Oligomycin也抑制自噬；MP則促進LC3-II的表達。
　　結論：1、阿霉素能夠呈劑量依賴性誘導MM細胞死亡，凋亡為其主要通路；2、阿霉素誘導細胞損傷可激活PARP酶的作用，聚ADP核糖基化作用被激活；3、阿霉素誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞產(chǎn)生自噬，進而高表達ATP，以保護細胞；4、PARP抑制劑ANI的非抑制濃度聯(lián)合阿霉素，可抑制自