一個新的調(diào)節(jié)成骨細胞分化的microRNA的克隆及其功能研究.pdf

1、第一部分一個新的成骨細胞優(yōu)先表達microRNA的克隆及表達分析
　　 目的:查找新的小鼠成骨細胞特異性表達或優(yōu)先表達的microRNA(migNA),并對其在多個組織器官和細胞中的表達模式進行研究。
　　 方法:首先提取小鼠成骨細胞的小分子RNA,經(jīng)過Poly(A)加尾并連接5'端接頭后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后進行PCR擴增、回收,連接至pcDNA3.1 TOPO載體構(gòu)建小分子RNA的cDNA文庫,最后進行菌落PCR,得

2、到的陽性克隆測序后選取19-26 nt大小的RNA進行生物信息學(xué)分析確定新的miRNA。用Northern印跡雜交檢測新的miRNA在小鼠成骨細胞、破骨細胞、骨、肝臟、心臟、肺、腎臟、大腦、脂肪、脾及骨骼肌的表達情況。用BMP-2誘導(dǎo)ST2細胞向成骨細胞分化,Northern印跡雜交檢測miRNA在此過程中的表達模式。
　　 結(jié)果:共克隆得到162個小分子RNA,有68個為miRNAs,包括2個新的miRNAs,其中1個提交mi

3、RBase數(shù)據(jù)庫后命名為miR-2861。miR-2861位于小鼠第2條染色體,在人類基因組中存在保守性。miR-2861在小鼠成骨細胞及骨高表達,在肝臟表達較低,
　　 在其他組織和破骨細胞不表達。miR-2861在ST2細胞不表達,BMP-2誘導(dǎo)ST2向成骨細胞分化12h后可以檢測到miR-2861表達,并隨著誘導(dǎo)分化時間的延長,表達逐漸增加。
　　 結(jié)論:首次構(gòu)建了小鼠成骨細胞小分子RNA的cDNA文庫。首次發(fā)現(xiàn)一

4、個新的成骨細胞優(yōu)先表達的miRNA-miR-2861。MiR-2861在小鼠與人之間具有保守性,其表達隨著成骨細胞分化的進展而逐漸升高,提示其可能參與了成骨細胞分化的調(diào)控過程。
　　 第二部分 miR-2861對成骨細胞分化影響的研究
　　 目的:研究miR-2861在小鼠基質(zhì)細胞ST2和原代骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)向成骨細胞分化中的作用。
　　 方法:根據(jù)miR-2861前體序列設(shè)計引物,退火后連接至pSil

5、encer4.1-CMV puro載體,構(gòu)建miR-2861的表達載體pre-miR-2861。將pre-miR-2861分別轉(zhuǎn)染ST2細胞和骨髓基質(zhì)細胞(bone marrowstromal cells,BMSCs),造成miR-2861過表達細胞模型,隨后予300ng/ml BMP-2誘導(dǎo)分化,觀察成骨細胞分化指標(biāo)變化。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性用分光光度計檢測對硝基苯酚釋放獲得,骨鈣素(Os

6、teocalcin,OC)用放射免疫測定法測定,細胞鈣沉積量用鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法檢測。Westem雜交和實時定量PCR分別檢測Runx2蛋白和mRNA表達的變化。用2'-O-methyl修飾的反義寡核苷酸anti-miR-2861瞬時轉(zhuǎn)染ST2細胞和BMSCs,同樣方法檢測ALP活性、OC分泌以及細胞中鈣沉積量變化,Runx2蛋白和mRNA表達分別用Western雜交和實時定量PCR檢測。
　　 結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染用pSilen

7、cer4.1CMV puro構(gòu)建的miR-2861表達載體pre-miR-2861能夠在細胞中穩(wěn)定地高表達miR-2861。(2)miR-2861過表達促進ST2和BMSCs向成骨細胞分化過程中的ALP活性增高和OC分泌,提高Runx2蛋白表達,而不影響Runx2 mRNA水平。ST2細胞轉(zhuǎn)染pre-miR-2861能夠增加細胞中的鈣沉積量(3)抑制miR-2861隆低ST2和BMSCs向成骨細胞分化過程中的ALP活性,減少OC分泌,降

8、低BMP-2誘導(dǎo)引起的Runx2蛋白表達升高,但不影響Runx2 mRNA水平,轉(zhuǎn)染ST2細胞5天后,鈣沉積含量較對照組降低。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了miR-2861表達載體,過表達miR-2861可以促進ST2和BMSCs向成骨細胞分化,抑制miR-2861能夠延緩ST2和BMSCs向成骨細胞分化。
　　 第三部分miR-2861調(diào)控成骨細胞分化的機制研究
　　 目的:預(yù)測并驗證miR-2861作用的靶基因,闡

9、明miR-2861促進成骨細胞分化的作用機制。
　　 方法:用多個靶基因預(yù)測軟件分析得到miR-2861作用的靶基因。PCR擴增包含靶位點在內(nèi)的靶基因編碼序列(coding sequence,CDS),產(chǎn)物連接到pGL3載體,構(gòu)建野生型靶基因CDS熒光素酶報告基因載體。以此為模板,用QuickChange site-directed mutagenesis試劑盒在靶位點中引入兩個堿基突變,構(gòu)建突變型靶基因CDS熒光素酶報告基因載

10、體。將這兩個載體分別與pre-miR-2861共同轉(zhuǎn)染ST2細胞,檢測熒光素酶活性變化以證實該靶基因是否為miR-2861作用的靶基因。ST2細胞單獨轉(zhuǎn)染pre-miR-2861,觀察miR-2861對靶基因表達的影響,Western雜交和實時定量PCR分別檢測靶基因蛋白和mRNA水平的變化,明確miR-2861對靶基因的調(diào)控作用。PCR擴增靶基因CDS全長cDNA,連接到pcDNA3.1(+)載體構(gòu)建野生型靶基因表達載體,以此為模板,

11、用QuickChange site-directed mutagenesis試劑盒在靶位點中引入兩個堿基突變,構(gòu)建突變型靶基因表達載體,這兩個載體分別與pre-miR-2861或miR-C共同轉(zhuǎn)染ST2細胞,加BMP-2誘導(dǎo)分化,觀察ALP活性和靶基因蛋白表達,ALP活性用分光光度計檢測對硝基苯酚釋放獲得,靶基因蛋白表達用Western雜交檢測。
　　 結(jié)果:(1)軟件預(yù)測HDAC5為miR-2861作用的靶基因。(2)與轉(zhuǎn)染m

12、iR-C對照組相比,miR-2861表達組HDAC5 CDS的熒光素酶活性顯著下降,而轉(zhuǎn)染突變型HDAC5 CDS的熒光素酶活性則無明顯變化。(3)單獨轉(zhuǎn)染pre-miR-2861可以降低HDAC5蛋白水平,而對HDAC5 mRNA無影響。(4)pre-miR-2861與野生型HDAC5 CDS表達載體共轉(zhuǎn)染可以增加ALP活性,降低HDAC5蛋白表達,而pre-miR-2861與突變型HDAC5 CDS表達載體共轉(zhuǎn)染則不會產(chǎn)生這種作用。