拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化與凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　骨骼是機(jī)體中重要的承重組織,力學(xué)刺激下的骨組織主要通過動(dòng)態(tài)的骨重建過程來調(diào)節(jié)其新陳代謝,從而適應(yīng)新的力學(xué)環(huán)境。骨重建過程是人類進(jìn)化的一種重要的生理反應(yīng),可以減少骨組織中骨量的流失,并保證骨組織結(jié)構(gòu)的完整性。骨重建過程受到機(jī)體中多種因素的調(diào)控,如遺傳因素、激素水平、代謝環(huán)境及力學(xué)刺激等。大量的研究表明,力學(xué)載荷在骨重建過程中發(fā)揮了重要作用:生理性動(dòng)態(tài)載荷可以促進(jìn)骨組織形成,而缺乏這種力學(xué)刺激會(huì)導(dǎo)致骨量的大量流失

2、,如廢用性骨質(zhì)疏松等。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是力學(xué)環(huán)境下骨重建過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,其中成骨細(xì)胞主要活性為促進(jìn)骨形成,而破骨細(xì)胞主要活性為促進(jìn)骨吸收。在不同的力學(xué)加載條件下,成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞均可直接感受力學(xué)信號(hào),并轉(zhuǎn)化為不同的生物學(xué)信號(hào),導(dǎo)致骨重建過程向骨形成或骨吸收方向發(fā)展,從而引起骨量的重新分配和骨結(jié)構(gòu)的重新排布。
　　目前認(rèn)為,骨組織的力學(xué)生物學(xué)效應(yīng)主要通過骨重建過程中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間的功能轉(zhuǎn)化來進(jìn)行調(diào)節(jié),但關(guān)于力學(xué)載荷下

3、成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間的相互作用及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過建立成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的體外共培養(yǎng)體系,觀察不同加載強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變作用下,成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化與凋亡的影響,并探討力學(xué)載荷下成骨細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞分化、凋亡的作用機(jī)制。
　　研究內(nèi)容與方法：
　　(1)建立成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的體外共培養(yǎng)體系。
　　采用MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞株與RAW264.7破骨前體細(xì)胞株,經(jīng)10-8mol/L的1α,25(OH)

4、2維生素D3(1α,25(OH)2D3)及50ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)作用,進(jìn)行體外成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,并利用Transwell小室(口部直徑2.4cm、底部面積4.67cm2、底膜為0.4μm孔徑的聚酯半透膜)建立成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。共培養(yǎng)6d后,通過細(xì)胞活性(MTT)實(shí)驗(yàn)、堿性磷酸酶(ALP)活力測(cè)定及蘇木素-伊紅(HE)染色鑒定共育體系中成骨細(xì)胞的增殖和分化活性;通過抗酒石酸酸性磷酸酶(

5、TRAP)染色、甲苯胺藍(lán)(TB)染色、TRAP活性測(cè)定及掃描電鏡技術(shù)(SEM)鑒定共育體系中破骨細(xì)胞的分化活性及骨吸收功能。
　　(2)基底拉伸應(yīng)變對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的影響。
　　采用四點(diǎn)彎曲力學(xué)加載裝置,對(duì)共育體系中成骨細(xì)胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據(jù)不同的加載強(qiáng)度將培養(yǎng)細(xì)胞分為0με、2500με、5000με三組,通過成骨細(xì)胞的MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)、ALP活性測(cè)定及ALP染色觀察不同加載

6、強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變對(duì)成骨細(xì)胞的增殖與分化活性的影響。
　　(3)拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　采用四點(diǎn)彎曲力學(xué)加載裝置,對(duì)共育體系中成骨細(xì)胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據(jù)不同的加載強(qiáng)度將培養(yǎng)細(xì)胞分為0με、2500με、5000με三組,通過破骨細(xì)胞的HE染色、TRAP染色、TB染色及TRAP活性測(cè)定,觀察不同加載強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化活性的調(diào)控作

7、用;通過骨板中骨吸收陷窩的檢測(cè)(TB染色)及破骨細(xì)胞中組織蛋白酶-K(Cath-k)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的活性測(cè)定(免疫化學(xué)染色、ELISA法),觀察不同加載強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。
　　采用四點(diǎn)彎曲力學(xué)加載裝置,對(duì)共育體系中成骨細(xì)胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據(jù)不同的加載強(qiáng)度將培養(yǎng)細(xì)胞分為0με、2500με、5000με三組,通過RT-PCR、West

8、ern blot及免疫化學(xué)染色方法,檢測(cè)不同加載強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞RANKL、OPG及EphA2的表達(dá)情況,同時(shí)觀察破骨細(xì)胞中EphA2的表達(dá)及NF-κB通路中信號(hào)分子p65的磷酸化水平,探討不同加載強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的分子機(jī)制。
　　(4)拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　采用四點(diǎn)彎曲力學(xué)加載裝置,對(duì)共育體系中成骨細(xì)胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5

9、HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據(jù)不同的加載強(qiáng)度及RANKL干預(yù)因子將培養(yǎng)細(xì)胞分為0με、2500με、2500με+RANKL、5000με、5000με+RANKL五組。通過流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中破骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率;通過Hoechst染色,觀察各實(shí)驗(yàn)組中破骨細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化;通過Westernblot技術(shù),檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中破骨細(xì)胞Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況,觀察不同加載強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變

10、作用下成骨細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　(1)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞體外共育體系的建立。
　　與單培養(yǎng)組比較,共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞在MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光度顯著下降(P<0.01);共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞ALP活性顯著升高(P<0.01);HE染色后,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組成骨細(xì)胞無限增殖速度減慢,細(xì)胞數(shù)量減少。與單培養(yǎng)組比較,共培養(yǎng)組破骨細(xì)胞TRAP活性顯著升高(P<0.01),TRAP染色明顯增強(qiáng);共培養(yǎng)組可見多個(gè)成熟

11、的破骨細(xì)胞,細(xì)胞體積增大,胞漿伸展、空泡化,并有多個(gè)細(xì)胞核;共培養(yǎng)組骨片上可見多個(gè)圓形的骨吸收陷窩,凹陷明顯,與周邊骨組織界限清楚。此結(jié)果顯示,共育體系中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化活性均明顯增強(qiáng)。
　　(2)基底拉伸應(yīng)變對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的影響。
　　對(duì)成骨細(xì)胞施加基底拉伸應(yīng)變3d后,與0με組比較,2500με組可顯著提高成骨細(xì)胞的增殖活性,表現(xiàn)為MTT實(shí)驗(yàn)中OD值顯著升高(P<0.05),2500με組可促進(jìn)成骨細(xì)胞AL

12、P活性的升高(P<0.05);而5000με組則降低成骨細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)與ALP活性(P<0.05);各實(shí)驗(yàn)組中成骨細(xì)胞ALP染色結(jié)果與ALP定量分析結(jié)果一致。此結(jié)果顯示,生理性拉伸應(yīng)變可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化,而超生理性拉伸應(yīng)變則抑制成骨細(xì)胞的增殖與分化。
　　(3)拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　對(duì)成骨細(xì)胞施加拉伸應(yīng)變3d后,與0με組比較,2500με組可顯著抑制破骨細(xì)胞的

13、分化和骨吸收功能,表現(xiàn)為多核破骨細(xì)胞的數(shù)量減少,TRAP活性降低(P<0.05),TRAP染色強(qiáng)度下降(P<0.01),骨片中骨吸收陷窩的面積減小(P<0.01),破骨細(xì)胞中Cath-k及MMP-9的表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01);5000με組中破骨細(xì)胞的TRAP活性、骨吸收陷窩面積及Cath-k、MMP-9的表達(dá)也顯著下降(P<0.01)。此結(jié)果顯示,拉伸應(yīng)變作用成骨細(xì)胞后,抑制了破骨細(xì)胞的分化與骨吸收功能。
　　對(duì)成

14、骨細(xì)胞施加拉伸應(yīng)變3d后,與0με組比較,2500με組可顯著升高成骨細(xì)胞中OPGmRNA及蛋白表達(dá)水平(P<0.01),而對(duì)RANKLmRNA及蛋白表達(dá)無顯著影響,由于OPG的高表達(dá),2500με組可顯著上調(diào)成骨細(xì)胞中OPG/RANKL表達(dá)的比值(P<0.01);與0με組比較,5000με組可顯著升高成骨細(xì)胞中OPGmRNA及蛋白表達(dá)水平(P<0.05),同時(shí)升高RANKLmRNA及蛋白表達(dá)水平(P<0.05),且上調(diào)成骨細(xì)胞中OP

15、G/RANKL表達(dá)的比值(P<0.05);與0με組比較,2500με及5000με組對(duì)成骨細(xì)胞中EphA2的表達(dá)均無顯著影響。此結(jié)果顯示,拉伸應(yīng)變作用成骨細(xì)胞后,對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用與上調(diào)成骨細(xì)胞OPG/RANKL表達(dá)的比值有關(guān)。
　　對(duì)成骨細(xì)胞施加拉伸應(yīng)變3d后,與0με組比較,2500με組可降低破骨細(xì)胞中p65磷酸化蛋白(p-p65)的表達(dá)(P<0.05),且OPG重組因子干預(yù)后可進(jìn)一步抑制p-p65的表達(dá)(P<0.01)

16、,并降低TRAP活性(P<0.01);與0με組比較,2500με及5000με組對(duì)破骨細(xì)胞中EphA2的表達(dá)均無顯著影響。此結(jié)果顯示,拉伸應(yīng)變作用成骨細(xì)胞后,對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用與下調(diào)破骨細(xì)胞中p65的磷酸化水平有關(guān)。
　　(4)拉伸應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　對(duì)成骨細(xì)胞施加拉伸應(yīng)變3d后,與0με組比較,2500με組可升高破骨細(xì)胞的凋亡率(P<0.01);與2500με組比較,2500με

17、+RANKL組則降低破骨細(xì)胞的凋亡率(P<0.05);與0με組比較,5000με組可升高破骨細(xì)胞的凋亡率(P<0.01);與5000με組比較,5000με+RANKL組則降低破骨細(xì)胞的凋亡率(P<0.01);各組破骨細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化與凋亡率的檢測(cè)結(jié)果一致。此結(jié)果顯示,拉伸應(yīng)變作用成骨細(xì)胞后,促進(jìn)了破骨細(xì)胞的凋亡發(fā)生,RANKL因子干預(yù)后可抑制破骨細(xì)胞的凋亡。
　　對(duì)成骨細(xì)胞施加拉伸應(yīng)變3d后,與0με組比較,2500με組

18、可顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.01);與2500με組比較,2500με+RANKL組則顯著抑制破骨細(xì)胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01);與0με組比較,5000με組可顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.01);與5000με組比較,5000

19、με+RANKL組則顯著抑制破骨細(xì)胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。此結(jié)果顯示,拉伸應(yīng)變作用成骨細(xì)胞后,對(duì)破骨細(xì)胞的促凋亡機(jī)制與激活破骨細(xì)胞中Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。
　　研究結(jié)論：
　　(1)Transwell共育體系中成骨樣細(xì)胞的無限增殖能力減弱,而分化活性增強(qiáng),同時(shí)破骨前體細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成熟的破骨細(xì)胞,并具有骨吸收功能。該共育體系可

20、用于探討力學(xué)環(huán)境下骨重建中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間信號(hào)調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。
　　(2)生理性拉伸應(yīng)變(2500με)可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化,繼而抑制共育體系中破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能,而超生理性拉伸應(yīng)變(5000με)則抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化,同時(shí)抑制共育體系中破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能。不同加載強(qiáng)度的拉伸應(yīng)變作用下,成骨細(xì)胞抑制共育體系中破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能的作用機(jī)制,可能與上調(diào)成骨細(xì)胞中OPG/RANKL表達(dá)的比值,繼