督脈電針促進脊髓損傷修復中的特異性神經肽及蛋白質表達的研究.pdf

1、本研究旨在探討督脈電針(GV-EA)在治療全橫斷脊髓損傷(SCI)大鼠的過程中的特異性作用機理。通過對督脈電針治療脊髓損傷后脊髓組織內特異性神經肽和功能蛋白的檢測，從而了解電針治療在脊髓損傷后的神經保護方面的分子機制，為祖國醫(yī)學在治療脊髓損傷時首選電針督脈建立可靠的理論基礎，并在蛋白水平上為脊髓損傷提供新的治療思路，本研究共分為三個部分。
　　 第一部分：督脈電針促進脊髓損傷修復中的穴位特異性蛋白表達的實驗研究
　　 目

2、的：檢測督脈電針在促進脊髓損傷修復過程中的差異蛋白的表達，為督脈電針的特異性作用機制提供實驗依據。
　　 方法：選用體重為200～250g的SD大鼠，隨機分為5組，正常對照組(normalgroup)，單純脊髓損傷組(SCI group)，督脈電針組(GV-EA+SCI group)，夾脊電針組(Jiaji-EA+SCI group)及非穴位電針組(npa-EA+SCI group)。3組電針組大鼠在經過T10脊髓節(jié)段全橫斷后7

3、d接受不同的電針治療，每天1次，每次電針20分鐘，于電針7d(新鮮取材)和30d(灌注取材)后取材。電針7d后的檢測分別取損傷區(qū)及其上下各1個節(jié)段的脊髓組織，先于-80℃凍存脊髓組織，樣品(組織提取液)溶解后開始進行蛋白組學的各項檢測。經二維凝膠電泳、計算機圖象分析與大規(guī)模數(shù)據處理以及質譜技術等步驟找出差異蛋白后，再做Western Blot、熒光免疫組化等后續(xù)實驗對蛋白組學檢測出的差異蛋白進行定量及定位的分析。電針30d后的大鼠取L1

4、脊髓節(jié)段背核，切片做中性紅染色和熒光免疫組化檢測。
　　 結果：雙向電泳結果顯示，與單純SCI組和穴位對照組相比，GV-EA+SCI組大鼠脊髓組織中有4種具有神經保護作用的蛋白表達顯著增高，它們分別是塌陷反應介導蛋白2(CRMP2)，膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5)，熱休克蛋白27(HSP27)和腦磷脂結合蛋白1(PEBP1)。Western Blot結果進一步驗證了CRMP2和ANXA5在GV-EA組的相應脊髓節(jié)段內的表達顯著高于單

5、純SCI組和穴位對照組。免疫熒光雙標法分析結果顯示，這4種差異蛋白在脊髓組織內的神經元、少突膠質細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞內均有一定水平的表達。同時，我們中性紅染色結果顯示電針治療，尤其是督脈電針治療能夠促進脊髓損傷后L1背核神經元的存活，另外，L1背核神經元內發(fā)現(xiàn)有ANXA5和CRMP2兩種差異蛋白的表達。
　　 結論：ANXA5和CRMP2是GV-EA促進脊髓損傷修復過程中具有穴位特異性的蛋白質，ANXA5和CRMP2可

6、能參與了督脈電針促進背核神經元存活的過程，從而發(fā)揮一定的神經保護作用。
　　 第二部分：督脈電針促進脊髓損傷修復中特異性神經肽的研究
　　 目的：本研究為了探尋督脈電針治療脊髓損傷后，損傷脊髓及其鄰近節(jié)段脊髓組織哪種神經肽分泌增多，且這種有一定神經保護作用的神經肽具有電針特異性。
　　 方法：選用體重為200～250g的SD大鼠，隨機分為5組，正常對照組(normalgroup)，單純脊髓損傷組(SCI grou

7、p)，督脈電針組(GV-EA+SCI group)，夾脊電針組(Jiaji-EA+SCI group)及非穴位電針組(npa-EA+SCI group)。3組電針組大鼠在經過T10脊髓節(jié)段全橫斷后7d接受不同的電針治療，每天1次，每次電針20分鐘，于電針7d后取材。對脊髓損傷處及其鄰近的上下節(jié)段的脊髓進行降鈣素基因相關肽(CGRP)的Western Blot和免疫熒光組織化學檢測，觀察相應節(jié)段脊髓組織內CGRP的含量變化。
　　

8、 結果：1.Western Blot結果顯示，與SCI組相比，npa-EA組和Jiaji-EA組脊髓組織的CGRP含量都有所增高，均達到正常水平，而GV-EA組脊髓組織的CGRP含量高于正常水平，且與其它4組相比，均有統(tǒng)計學差異。2.免疫熒光組織化學檢測結果顯示，CGRP在損傷鄰近節(jié)段脊髓背角的表達主要集中在第Ⅰ、Ⅱ板層，陽性反應區(qū)占脊髓背側1/2面積的百分比在幾組中的比較與Western blot結果基本保持一致。
　　 結論

9、：從實驗設立SCI組、穴位對照組和非穴位對照組來看，GV-EA組脊髓CGRP的表達量都高于對照組。以上結果表明，CGRP是GV-EA治療SCI過程中特異性表達的一種神經肽，該神經肽具有一定的穴位特異性，GV-EA可能是通過對CGRP的表達調節(jié)來激發(fā)損傷脊髓組織的結構修復和神經再生的。
　　 第三部分：降鈣素基因相關肽CGRP對體外受損傷的大鼠小腦顆粒神經元存活的影響
　　 目的：本章實驗欲通過檢測CGRP對體外培養(yǎng)的受損

10、傷的大鼠小腦顆粒神經元存活及其ANXA5和CRMP2表達的影響，來間接證實CGRP促進受損傷神經元存活的作用和CGRP與兩種差異蛋白(ANXA5和CRMP2)之問的關系。
　　 方法：出生7～8 d的SD乳鼠，小心地分離出小腦組織，經胰酶、DNA酶消化后，細胞按每毫升1.5×106個的密度接種在多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)板中(本實驗選用的是6孔板，且孔板里放有蓋玻片)，培養(yǎng)小腦顆粒神經元。在神經元培養(yǎng)至7～8d胞體成熟、突起豐富的

11、時候，建立劃痕損傷模型，損傷同時加入一定劑量(10-6M和10-7M)的CGRP，在熒光顯微鏡下觀察細胞之前的1h加2μM calceinAM(標記活細胞)和4μM EthD-Ⅲ(標記死亡細胞)，加之后在37℃下孵育1h，然后在熒光顯微鏡下觀察和計數(shù)，其中calcein AM標記的活細胞在鏡下顯綠色，EthD-Ⅲ標記的死亡細胞在鏡下顯紅色。另外，對損傷組、加入CGRP的損傷組及正常的小腦顆粒神經元還做了ANXA5/CRMP2跟Hoech

12、st33342的雙標檢測，間接反映CGRP與差異蛋白ANXA5/CRMP2的關系。
　　 結果：通過對各組小腦顆粒神經元存活率的檢測，結果顯示，跟正常組相比，單純損傷組神經元的存活率明顯降低，不管是損傷后1h、6h還是12h組：同時加CGRP的損傷組神經元的存活率盡管遠不及正常組，但是跟單純損傷組相比從6h開始存活率已經開始增高，持續(xù)到損傷后12h仍然高于損傷組。另外，CGRP的兩個劑量(10-6M和10-7M)組之間在相應時間

13、段對神經元存活率的影響沒有明顯差異。經過對normal組、injury組(6h)和injury(6h)+CGRP(10-7M)組小腦顆粒神經元中ANXA5和CRMP2陽性細胞百分率的統(tǒng)計處理，含有10-7M CGRP的損傷組，跟injury(6h)組相比，兩種蛋白的陽性細胞百分率沒有明顯變化。
　　 結論：在GV-EA治療SCI的過程中產生的特異性神經肽CGRP具有一定的神經保護作用，可能是通過促進受損傷神經元的存活，從而有助于