人羊膜細胞的原代培養(yǎng)和在Ⅰ型膠原蛋白支架上的三維培養(yǎng)用于修復胎膜破口的研究.pdf

1、目的：建立人羊膜上皮細胞和羊膜間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)和細胞純化的方法；選擇促進人羊膜細胞增殖的最佳培養(yǎng)基；構(gòu)建人羊膜細胞/I型膠原蛋白支架復合物以用于修復胎膜破口的研究。 方法：1.通過酶消化法對羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞進行分離和純化。應用免疫細胞化學方法對人羊膜上皮細胞和羊膜間質(zhì)細胞進行細胞鑒定。 2.利用分光光度劑測定人羊膜細胞在4種不同的培養(yǎng)基下的細胞增殖狀況。Ⅰ組：DMEM/F12+10％FBS+50.0ng/mlEG

2、F+2.5ug/ml胰島素+5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+0.1ng/ml T3；Ⅱ組：DMEM/F12+10％FBS；Ⅲ組：DMEM/F12+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰島素+5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+0.1ng/ml T3；Ⅳ組：DMEM/F12+50.0ng/mlEGF。 3.將羊膜間質(zhì)細胞嵌入三維基質(zhì)中，羊膜上皮細胞接種在基質(zhì)的表面，構(gòu)建人羊膜細胞/Ⅰ型膠原蛋白支架復合物以模擬人體羊膜組織結(jié)構(gòu)。 4.DAPI

3、標記三維基質(zhì)中的細胞核以計數(shù)人羊膜細胞在三維培養(yǎng)第2，8天的細胞數(shù)量。耦合羅丹明的鬼筆環(huán)肽染色標記可特異性地顯示細胞骨架中的微絲(F-actin)結(jié)構(gòu)以觀察細胞在三維基質(zhì)中的細胞形態(tài)。掃描電鏡和透射電鏡觀察羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞在三維培養(yǎng)中的超微結(jié)構(gòu)。 5.培養(yǎng)含有不同數(shù)量羊膜間質(zhì)細胞的人羊膜細細胞/Ⅰ型膠原蛋白支架復合物，15 d后檢測抗張強度。 結(jié)果： 1.采用胰蛋白酶和膠原酶先后消化的方法可以將羊膜上皮細胞和間質(zhì)細

4、胞進行細胞分離培養(yǎng)。人羊膜細胞體外培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的細胞增殖能力和傳代能力。2.羊膜間質(zhì)細胞在缺少胎牛血清的培養(yǎng)基里缺乏增殖能力。人羊膜細胞在含有胎牛血清、表皮生長因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及三碘甲腺原氨酸的培養(yǎng)基里表現(xiàn)出較其余3組更強的細胞增殖能力(P＜0.001)。(羊膜上皮細胞Ⅰ組：1.130±0.203：Ⅱ組：0.487±0.141；Ⅲ組：0.466±0.094；Ⅳ組：0.451±0.144。羊膜間質(zhì)細胞Ⅰ組：1.356±0.173：

5、Ⅱ組：0.930±0.112；Ⅲ組：0.200±0.053；Ⅳ組：0.190±0.029)。3.人羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞在Ⅰ型膠原蛋白基質(zhì)中的培養(yǎng)顯示出與體內(nèi)人羊膜細胞的相似性，人羊膜細胞在三維培養(yǎng)的過程中細胞數(shù)量無明顯增加，人羊膜間質(zhì)細胞可導致I型膠原蛋白的收縮，抑肽酶和GM6001也不能抑制這種收縮。4.人羊膜細胞/Ⅰ型膠原蛋白復合物抗張強度隨人羊膜間質(zhì)細胞數(shù)量的增多而增強(P＜0.001)。 結(jié)論： 1.羊膜上皮細胞和間質(zhì)