小膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及純化鑒定的實驗研究.pdf

1、目的：
　　建立一種新生KM小鼠小膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)的可行方法，并對所得小膠質(zhì)細胞的純度進行鑒定。
　　方法：
　　選用出生24小時以內(nèi)的KM小鼠。用純物理方法提取大腦皮層原代細胞后進行混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，并輔以營養(yǎng)剝離法。原代混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)10-14天，待觀察到細胞充分分層生長后，以普通濃度胰酶和低濃度胰酶消化分別分離純化小膠質(zhì)細胞。通過細胞計數(shù)計算產(chǎn)量，細胞密度計算公式:（4個大格的細胞個數(shù)之和/4）×104個/毫升

2、細胞懸液。利用Iba1免疫細胞化學染色的方法對其純度進行鑒定，陽性細胞即為小膠質(zhì)細胞。在隨機選取的7個高倍鏡視野下計數(shù)陽性細胞數(shù)和細胞核總數(shù)，并計算陽性細胞率，即小膠質(zhì)細胞純度(％)=陽性染色細胞數(shù)/細胞核總數(shù)×100％。
　　結(jié)果：
　　原代神經(jīng)膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)24小時后可以觀察到，有少量細胞貼壁，形態(tài)大多未完全展開。隨后細胞數(shù)目逐日增多，并出現(xiàn)聚堆生長，處于底層的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)開始逐漸鋪開?；旌吓囵B(yǎng)5-7天時開始明顯分

3、層生長，混合培養(yǎng)10-14天時，成堆分層生長的細胞連成片，小膠質(zhì)細胞數(shù)目越來越多，且大多處于靜息狀態(tài)。分離培養(yǎng)后第7天，小膠質(zhì)細胞的突起變長，多級突起細胞數(shù)目增加，此時大部分細胞轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài)。通過單獨使用營養(yǎng)剝離法純化培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞的產(chǎn)量為7.3×105個/瓶(25cm2)，通過營養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法純化培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)量為1.0×106個/瓶(25cm2)。用PBS溶液代替一抗作對照染色，結(jié)果為陰性。Iba1為小膠質(zhì)細胞的標記

4、物，經(jīng)過Iba1免疫細胞化學染色，單獨使用營養(yǎng)剝離法純化培養(yǎng)所得陽性細胞數(shù)為56.29±3.30個/視野，細胞核總數(shù)為79.14±5.05個/視野，小膠質(zhì)細胞純度為71.17±2.30％;營養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法所得陽性細胞數(shù)為73.14±9.23個/視野，細胞核總數(shù)為76.29±10.03個/視野，小膠質(zhì)細胞純度為95.95±1.26％。與單用營養(yǎng)剝離法相比，營養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法所得陽性細胞數(shù)和小膠質(zhì)細胞純度，差異有統(tǒng)計學

5、意義(P＜0.05);所得細胞核總數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。用營養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法進行分離純化，成功獲得了純度＞95％的小膠質(zhì)細胞。
　　結(jié)論：
　　1.本研究采用純物理方法提取原代細胞，用營養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法分離純化所得到的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)量為1.0×106個/瓶(25cm2)，純度為95.95±1.26％。
　　2.用營養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法分離純化所得小膠質(zhì)細胞產(chǎn)量及純度滿足進一步實驗要