聯(lián)合應(yīng)用Rho-ROCKII及GSK-3β抑制劑促進(jìn)新生大鼠DRGNs軸突再生的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： （1）觀察完全性截癱大鼠脊髓提取液對(duì)新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元（DRGNs）軸突生長(zhǎng)的影響； （2）觀察聯(lián)合應(yīng)用Rho—ROCKⅡ和GSK—3β抑制劑對(duì)大鼠背根節(jié)神經(jīng)軸突再生和延長(zhǎng)的影響。 方法： （1）健康雌性SD成年大鼠15只，隨機(jī)分為：手術(shù)癱瘓組（5只）、假手術(shù)對(duì)照組（5只）和正常組（5只）。WD法制成SD大鼠T9平面完全性截癱的脊髓損傷動(dòng)物模型，造模7d后取T8—10節(jié)段脊髓制作脊髓提取液。

2、 （2）新生大鼠DRGNs體外培養(yǎng)：取新生SD大鼠（<5d），顯微操作下取胸腰段背根節(jié)（20～25個(gè)/只），酶解消化、機(jī)械吹打、離心、重懸、純化，進(jìn)行元代培養(yǎng)觀察與鑒定。 （3）實(shí)驗(yàn)一分組：A組，DRGNs+PBS；B組，DRGNs+正常脊髓提取液：C組，DRGNs+假手術(shù)脊髓提取液；D組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液。 （4）實(shí)驗(yàn)二分組：A組，DRGNs+PBS；B組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液；

3、C組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液+Y26732；D組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液+TDZD—8；E組，DRGNs+完全性截癱大鼠脊髓提取液+Y26732+TDZD—8。 （5）觀察指標(biāo)：共同培養(yǎng)1、2d后相差顯微鏡下照相、固定后免疫熒光，觀察神經(jīng)軸突長(zhǎng)度、TubulinβⅢ陽(yáng)性表達(dá)以及軸突遠(yuǎn)端平均熒光密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件做單因素方差分析。 結(jié)果： （1）實(shí)驗(yàn)一各組共同培養(yǎng)

4、1d平均神經(jīng)軸突長(zhǎng)度：A組為144±28um，B組為134±11um，C組為125±30um，D組為47±5um；共同培養(yǎng)2d后：A組為211±21um，B組為182±15um，組為156±13um，D組80±8um。共同培養(yǎng)1、2d后，D組和A、B、C組之間分別比較差別有顯著性；C組和A、B組之間分別比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A和B組之間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共同培養(yǎng)2d后，軸突遠(yuǎn)端平均熒光密度分別是：A組為200.4±4.0AFU/um

5、，B組為199.2±6.6 AFU/um，C組為194.6±7.0AFU/um；D組為75.1±4.1AFU/um。在A組和B組中，神經(jīng)軸突干和生長(zhǎng)錐的TubulinβⅢ陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)，而C組中TubulinβⅢ陽(yáng)性表達(dá)弱，D組比C組TubulinβⅢ陽(yáng)性表達(dá)更弱，特別在軸突遠(yuǎn)端和生長(zhǎng)錐。D組和A、B、C組之間分別比較差別有顯著性； A、B、C組之間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （2）實(shí)驗(yàn)二各組共同培養(yǎng)2d后平均神經(jīng)軸突長(zhǎng)度：A組為402

6、±33um，B組為125±18um，C組為404±14um，D組為398±41um，E組為405±12um。B與其他組之間兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、D、E組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共同培養(yǎng)2d后，軸突遠(yuǎn)端平均熒光密度分別是：A組為208.2±5.6 AFU/Um，B組為67.1±4.2 AFU/um，C組為362.6±5.6 AFU/um，D組為365.6±39.3AFU/um，E組為379.8±23.6 AFU/um。在A、C、D

7、和E組中，神經(jīng)軸突干和生長(zhǎng)錐的TubulinβⅢ陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)，而B(niǎo)組中TubulinβⅢ陽(yáng)性表達(dá)弱，特別在軸突遠(yuǎn)端和生長(zhǎng)錐。B組和其他組差別均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E組和A、C、D組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： （1）完全癱瘓脊髓提取液能明顯抑制DRGNs軸突生長(zhǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷；假手術(shù)脊髓提取也能輕度抑制軸突生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)錐無(wú)明顯塌陷；正常脊髓不影響軸突生長(zhǎng)。 （2）30uMY27632能明顯促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，形成細(xì)長(zhǎng)的生長(zhǎng)