Rho-ROCKⅡ特異抑制性小分子多肽與TDZD-8促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生的對比實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:(1)對比Rho/ROCKⅡ特異抑制性小分子多肽與TDZD-8對大鼠DRGNs軸突再生的影響;(2)對比Rho/ROCKⅡ特異抑制性小分子多肽與TDZD-8對脊髓損傷后軸突再生和功能恢復(fù)的影響。
　　方法:
　　(1)體外實(shí)驗(yàn):①隨機(jī)選擇健康雌性SD成年大鼠5只,按WD法制成T9平面以下截癱模型,術(shù)后7天取T8-T10節(jié)段脊髓,制作截癱大鼠脊髓提取液;②取新生SD大鼠(<5d)背根神經(jīng)節(jié)經(jīng)酶解消化、機(jī)械吹打、離心、重懸

2、、純化,進(jìn)行原代培養(yǎng)觀察;③實(shí)驗(yàn)分組:A組,DRGNs+60μlPBS;B組,DRGNs+60μl截癱大鼠脊髓提取液;C組,DRGNs+60μl截癱大鼠脊髓提取液+20μl脂質(zhì)體;D組,DRGNs+60μl截癱大鼠脊髓提取液+1μM TDZD-8;E組,DRGNs+60μl截癱大鼠脊髓提取液+20μl脂質(zhì)體+8μg多肽。在不同環(huán)境下共同培養(yǎng)兩天后相差顯微鏡下照相、固定、行免疫熒光,測量神經(jīng)軸突長度,觀察TubulinβⅢ陽性表達(dá)以及軸突

3、遠(yuǎn)端平均熒光密度。
　　(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):①取健康成年雌性SD大鼠210只,隨機(jī)分為7組,每組30只, A組:正常組;B組:假手術(shù)組(僅咬開椎板,不損傷脊髓);C組:空白對照組(致癱后不注射任何藥物);D組:PBS液組(經(jīng)導(dǎo)管注射20μL PBS);E:脂質(zhì)體組(經(jīng)導(dǎo)管注射20μL脂質(zhì)體溶液);F組:TDZD-8組(經(jīng)導(dǎo)管注射20μL(1μM)TDZD-8);G組:多肽組(經(jīng)導(dǎo)管注射脂20μL質(zhì)體+8μgROCK2競爭抑制性小分子多

4、肽)。C-G組按WD法制成T9平面以下截癱模型,并在L4平面蛛網(wǎng)膜下腔植入注藥用的軟導(dǎo)管,B組僅咬開椎板,不損傷脊髓,A組不作任何處理。術(shù)后1h起各組,經(jīng)導(dǎo)管鞘內(nèi)注射不同藥物,每天一次,共2 W。②分別于術(shù)后8h、24h、72h、1W、2W隨機(jī)各取5只大鼠經(jīng)灌注、固定、取材、脫水后石蠟固定。③取各組標(biāo)本行HE染色,觀察組織變化情況;取8h、24h、72h、1W標(biāo)本行TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況;取24h、72h、1W、2W標(biāo)本按SP法

5、行免疫組化,觀察GAP-43表達(dá)情況;每組隨機(jī)選擇5只大鼠于術(shù)后24h、3W、6W、8W作體感誘發(fā)電位觀察潛伏期和波幅;術(shù)后第6W行順行示蹤,注射后2W取脊髓行冰凍切片,觀察各組軸突的生長情況;3、6、8W作BBB評分。④各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)用X-±s表示,應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析。
　　結(jié)果:(1)體內(nèi)部分:各組共同培養(yǎng)兩天后,測量60個(gè)軸突長度均數(shù)為:A組:319.78±51.86um,B組:107.59±27.5

6、3um,C組:101.03±32.37um,D組:282.05±45.79um,E組:296.57±36.81um。各組軸突遠(yuǎn)端平均熒光密度為:A組:207.95±4.90AFU/Um,B組:66.13±4.45 AFU/Um,C組:66.31±6.01 AFU/Um,D組:267.81±13.21 AFU/Um,E組:309.59±17.08 AFU/Um。經(jīng)單因素方差分析,B、C組分別與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),

7、B、C組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);D組與E組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。(2)①HE染色:G組與其他各組相比,神經(jīng)細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量更多,變性細(xì)胞及紅細(xì)胞數(shù)量較少;組織水腫和空洞形成也較輕;②GAP-43的表達(dá):術(shù)后24 h(mm2):A組31.11±1.82,B組37.05±1.43,C組42.23±2.89,D組41.98±2.87,E組42.21±2.37,F組74.33±3.55,G組82.86±3.31

8、;術(shù)后72h(mm2):A組31.55±1.37,B組39.65±2.27,C組50.53±2.73,D組52.39±2.52,E組52.18±3.24,F組84.93±4.31,G組94.39±3.49;術(shù)后1W(mm2):A組31.13±1.64,B組43.23±2.98,C組64.63±3.45,D組65.31±3.45,E組65.21±3.73,F組108.76±6.48,G組113.30±7.38;術(shù)后2W(mm2):A組31

9、.11±1.49,B組44.71±3.67,C組53.22±5.45,D組51.51±5.49,E組52.81±4.80,F組157.83±5.02,G組169.37±7.96。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),F組和G組生長相關(guān)蛋白面積均大于 C、D、E組(P<0.01),有統(tǒng)計(jì)差異;C、D、E組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);A組和B組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05); G組生長相關(guān)蛋白面積均大于F組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。③凋亡細(xì)胞數(shù):術(shù)后

10、8h:A組7.86±1.45,B組9.33±2.44,C組49.00±5.49,D組49.60±5.11,E組50.53±4.27,F組44.53±3.85,G組39.73±4.06;術(shù)后24h:A組8.53±1.41, B組10.20±3.42,C組54.80±5.39,D組54.80±5.41,E組54.67±4.82,F組47.33±3.89,G組42.40±5.45;術(shù)后72h:A組8.40±1.90,B組9.27±2.40,

11、C組45.60±3.80,D組46.20±5.63,E組45.87±7.64,F組38.47±4.75, G組31.45±5.07;術(shù)后1W:A組7.33±1.59,B組7.73±1.58,C組15.67±2.26, D組15.53±2.26,E組15.47±2.50,F組12.53±3.36,G組10.27±3.15。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),F組和G組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)均小于C、D、E組(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)差異;C、D、E組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

12、>0.05);A組和B組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05); G組凋亡細(xì)胞數(shù)均小于F組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。④順行示蹤熒光面積:損傷節(jié)段各組熒光面積(mm2):A組220.80±10.39,B組95.01±5.39, C組34.06±1.78,D組35.96±3.29,E組35.18±2.85,F組76.48±1.11,G組84.68±2.45;損傷節(jié)段以下各組熒光面積(mm2):A組220.80±10.39,B組73.80±3

13、.49,C組14.18±2.04,D組14.48±3.33,E組14.02±1.71,F組33.46±2.77,G組43.20±1.54。損傷節(jié)段及損傷節(jié)段以下F組和G組熒光面積均大于于C、D、E組(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)差異,C、D、E組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);B-G各組熒光面積均小于A組,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);G組熒光面積均大于F組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。⑤SEP波幅及潛伏期:各組術(shù)前潛伏期(ms)

14、:A組14.36±1.94,B組15.98±3.41, C組15.98±1.68,D組16.12±1.29,E組16.06±3.69,F組15.40±2.18,G組16.16±2.30;術(shù)后一天各組潛伏期(ms):A組16.10±1.39,B組15.96±3.61,C組37.44±5.12, D組36.84±5.46,E組36.52±4.35,F組35.70±4.45,G組38.30±1.46;術(shù)后3W各組潛伏期(ms):A組15.34

15、±1.41,B組16.02±3.85,C組35.94±4.61, D組35.90±5.61,E組35.66±3.99,F組30.42±1.02,G組26.34±0.94;術(shù)后6W各組潛伏期(ms):A組14.70±0.82,B組16.24±1.97, C組31.42±2.30,D組31.02±3.44,E組30.74±0.95,F組26.60±1.66,G組23.26±2.81;術(shù)后8W各組潛伏期(ms):A組14.38±1.35,B組

16、14.44±1.47, C組28.40±1.05,D組29.03±5.59,E組28.94±4.46,F組23.56±3.45,G組19.10±2.47。術(shù)前各組潛伏期均無明顯差異(P>0.05),術(shù)后24小時(shí)C—G組潛伏期和術(shù)前有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。術(shù)后3、6、8W,各時(shí)間點(diǎn)G組和F組潛伏期均低于C、D、E組,之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);C、D、E組之間潛伏期均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);G組潛伏期均低于F

17、組,之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。各組術(shù)前波幅(μV):A組15.30±4.11,B組16.48±4.58, C組15.50±3.04,D組15.32±3.52,E組16.00±3.32,F組17.26±3.23,G組15.60±2.29;術(shù)后一天各組波幅(μV):A組15.18±4.05,B組14.98±1.95,C組1.26±0.30, D組1.28±0.61,E組1.16±0.46,F組1.28±0.48,G組1.22±0

18、.43;術(shù)后3W各組波幅(μV):A組14.96±3.39,B組16.06±2.99,C組1.46±0.48,D組1.36±0.4,E組1.32±0.56,F組4.88±0.26,G組6.92±0.36;術(shù)后6W各組波幅(μV):A組14.96±3.10,B組16.52±1.29,C組2.62±0.94,D組2.28±0.30,E組2.68±0.58,F組5.48±0.99,G組9.48±3.27;術(shù)后8W各組波幅(μV):A組15.1

19、4±2.33,B組16.18±3.44,C組2.8±0.82,D組2.94±0.71,E組3.20±0.78,F組6.94±0.36, G組0.07±3.67。術(shù)前各組波幅均無明顯差異(P>0.05),術(shù)后24hC—G組波幅和術(shù)前有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。術(shù)后3、6、8W,各時(shí)間點(diǎn)G組和F組波幅均高于C、D、E組,之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);C、D、E組之間均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);G組波幅均高于 F組,二者

20、之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。⑥BBB評分:術(shù)后3、6、8W A、B兩組評分均為21分。術(shù)后3W C-G組評分為:C組5.0±1.59,D組5.0±2.35,E組5.2±0.84,F組7.6±1.14,G組10.0±2.0;術(shù)后6W C-G組評分為:C組5.6±2.07,D組5.8±2.78,E組5.8±1.30,F組9.4±1.82, G組2.0±2.35;術(shù)后8W C-G組評分為C組:8.0±1.00,D組8.2±2.17,

21、E組8.0±1.00, F組12.4±1.95,G組15.8±1.92。各時(shí)間點(diǎn)G組、F組評分和C、D、E組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);G組評分大于F組,二組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);而C、D、E組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:(1)Rho/ROCK Ⅱ特異抑制性小分子多肽能促進(jìn) DRGNs軸突生長,有利于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成,且效果優(yōu)于TDZD-8。(2) Rho/ROCK Ⅱ特異抑制性小分子多肽能抑