金蕎麥提取物對肥大細胞介導的腹瀉型腸易激綜合征的作用及其機制初探.pdf

1、[研究目的與意義]
　　目前諸多研究表明肥大細胞(MC)及其釋放的相關介質(zhì)是導致腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，因此針對MC的治療是中西醫(yī)研究的熱點與難點。本課題擬:(1)從體內(nèi)實驗驗證金蕎麥提取物(Fag)對D-IBS模型大鼠胃腸道動力紊亂、內(nèi)臟高敏感性、腸黏膜低度炎癥、腸黏膜屏障受損及MC活化脫顆粒的影響;(2)從體外實驗探討Fag治療抗原誘導的MC活化脫顆粒的分子機制。從而拓寬了金蕎麥的臨床適應癥范圍，為開發(fā)

2、具有自主知識產(chǎn)權的新藥物奠定實驗基礎，具有可觀的臨床應用價值和市場前景。
　　[研究方法]
　　1、體內(nèi)實驗
　　(1)予新生期母嬰分離聯(lián)合乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射建立D-IBS大鼠模型，通過統(tǒng)計D-IBS模型大鼠排便顆粒數(shù)、觀察糞便Bristol分級、腹壁回撤反應(AWR)、腸黏膜HE染色等方法評價模型的可靠性。(2)觀察Fag對D-IBS模型大鼠排便顆粒數(shù)、糞便Bristol分級、AWR、腸黏膜HE染色的影響

3、。予免疫組化檢測D-IBS模型大鼠腸黏膜MC數(shù)目及活化脫顆粒程度;予免疫組化、ELISA法檢測遠端結(jié)腸黏膜類胰蛋白酶(tryptase)水平;予免疫組化、Western blot檢測遠端結(jié)腸蛋白酶激活受體2(PAR-2)表達;予ELISA法檢測遠端結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6的表達;予免疫組化、ELISA法檢測遠端結(jié)腸黏膜P物質(zhì)(SP)表達;予Western blot檢測遠端結(jié)腸occludin蛋白表達;觀察Fag對上述指標的作用。

4、r>　　2、體外實驗
　　通過抗原誘導大鼠嗜堿性白血病細胞(RBL-2H3)建立MC活化脫顆粒模型。予MTS法檢測Fag對RBL-2H3細胞的增殖活性，篩選Fag的安全工作濃度;予底物顯色反應檢測RBL-2H3細胞上清β-Hex釋放;予ELISA檢測細胞上清tryptase、TNF-α、IL-6水平;予Weaternblot檢測抗原誘導的RBL-2H3活化脫顆粒相關受體及蛋白FcεRI、p-Lyn、Lyn、p-Syk、Syk、MA

5、PK家族(p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、ERK1/2、JNK、p38)、p-AKT、AKT、p-Plcγ1/2、p-PKCβ的表達，觀察Fag對上述指標的作用。
　　[結(jié)果]
　　1、體內(nèi)實驗
　　(1)模型改良及評價:采用新生期母嬰分離、乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射三法復制的模型，大鼠表現(xiàn)出皮毛色澤變暗、活動度減少、喜好扎堆等表現(xiàn);排便顆粒數(shù)增加、糞便Bristol分級升高、20、40、60mmHg球囊

6、壓力下AWR評分增高、腸黏膜HE染色存在少量炎性細胞浸潤。該復合造模方法可基本復制D-IBS模型。
　　(2) Fag對D-IBS模型大鼠整體療效評價:①Fag各劑量組對大鼠體重增長率無明顯影響，與酮替芬組療效相當。②Fag中、高劑量組可有效減少排便顆粒數(shù)，高劑量組與酮替芬組療效相當。③Fag中、高劑量組可有效降低糞便Bristol分級，與酮替芬組均療效相當。④20mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag中、高劑量組、酮替芬組可有效降低AWR評

7、分，高劑量組與酮替芬組療效相當;40mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag中、高劑量組、酮替芬組可有效降低AWR評分，且高劑量組療效優(yōu)于酮替芬組;60mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag高劑量組、酮替芬組可有效降低AWR評分，兩組療效相當;80 mmHg球囊壓力下，F(xiàn)ag各劑量組、酮替芬組對AWR評分無影響。⑤Fag中、高劑量組、酮替芬組均可降低腸黏膜低度炎癥。
　　(3) Fag對D-IBS模型大鼠MC及其相關物質(zhì)的作用:①Fag高劑量組、酮替芬組可

8、減少MC數(shù)目，高劑量組與酮替芬組療效相當;Fag中、高劑量組、酮替芬組可抑制MC活化脫顆粒，高劑量與酮替芬組療效相當。②Fag中、高劑量組、酮替芬組可降低遠端結(jié)腸黏膜tryptase表達，高劑量組與酮替芬組療效相當。③Fag中、高劑量組、酮替芬組可顯著降低遠端結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-6水平，F(xiàn)ag高劑量組與酮替芬組療效相當。④Fag中、高劑量組、酮替芬組可顯著降低遠端結(jié)腸黏膜上皮PAR-2蛋白表達，高劑量組與酮替芬組療效相當。⑤Fag

9、中、高劑量組、酮替芬組可顯著降低遠端結(jié)腸SP表達，且Fag高劑量療效優(yōu)于酮替芬組。⑥Fag中、高劑量組、酮替芬組可顯著提高遠端結(jié)腸occludin蛋白表達。
　　2、體外實驗
　　(1) Fag在3-50μg/ml濃度范圍內(nèi)對細胞增殖活性無抑制作用，選擇10、30、50μg/ml濃度范圍作為Fag的安全工作濃度。
　　(2) Fag中、高劑量對抗原誘導的RBL-2H3細胞β-HEX釋放率具有抑制作用。
　　(3)

10、 Fag中、高劑量組可抑制RBL-2H3細胞tryptase釋放。
　　(4) Fag中、高劑量組可抑制RBL-2H3細胞TNF-α、IL-6釋放。
　　(5)各濃度Fag對上游蛋白FcεRI、p-Lyn、Lyn、p-Syk、Syk無明顯作用。
　　(6) Fag可抑制p-JNK、p-p38、p-ERK1/2表達，但具有選擇性，其中Fag中、高劑量組對p-JNK、p-ERK1/2蛋白的作用明顯，F(xiàn)ag高劑量組對p-p3

11、8蛋白作用明顯，各濃度Fag對JNK、p38、ERK1/2表達均無明顯作用。
　　(7)各濃度Fag對p-AKT、AKT蛋白均無明顯作用。
　　(8)各濃度Fag對p-Plcγ1/2蛋白均無明顯作用，F(xiàn)ag中、高劑量可抑制p-PKCβ蛋白表達。
　　結(jié)論:
　　1、體內(nèi)實驗
　　(1)新生期母嬰分離聯(lián)合乙酸灌腸、雞卵清白蛋白腹腔注射可模擬D-IBS胃腸道動力增高、腸黏膜屏障受損、內(nèi)臟高敏感、腸黏膜低度炎癥等

12、特征。
　　(2) Fag可劑量依賴性地降低D-IBS模型大鼠降低內(nèi)臟高敏感，減輕腸黏膜低度炎癥，緩解胃腸動力亢進、改善腸黏膜屏障受損的機制與抑制D-IBS模型大鼠腸黏膜MC數(shù)量及活化脫顆粒，降低促炎細胞因子TNF-α、IL-6及類胰蛋白酶釋放，下調(diào)PAR-2受體，減少SP釋放，上調(diào)occludin蛋白有關。與酮替芬相比，F(xiàn)ag降低內(nèi)臟痛覺（40mmHg球囊壓力下）的療效優(yōu)于酮替芬，其余各項指標兩者療效相當。
　　2、細胞實