木豆葉芪類提取物及其合成類似物調(diào)節(jié)膽固醇代謝和血管保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病最重要的發(fā)病因素。在動脈粥樣硬化的誘發(fā)因子中，高脂血癥是一個主要的獨立危險因素。所以從藥用植物中尋找具有降血脂作用的天然化合物，并研究其作用機(jī)理是近年來的研究熱點，具有重大的應(yīng)用前景和社會效益。在對高脂血脂誘發(fā)動脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoprotein-cholestero，LDL-C)是主要的致病因子之一。近期的研究表明膽固

2、醇的逆向轉(zhuǎn)運過程(reversecholesteroltransport，RCT)在改善血脂代謝，防治動脈粥樣硬化中的作用越來越重要。RCT過程能夠促進(jìn)外周組織膽固醇的清除，降低體內(nèi)膽固醇水平，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。 本課題組在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，豆類植物木豆的葉子提取物能明顯降低動物的體重和血糖水平。木豆葉總提取物中主要包含芪類成分和黃酮類成分，可用于治療婦女更年期綜合癥、防治骨質(zhì)疏松、降低血糖。但是，關(guān)于木豆葉提取物調(diào)

3、節(jié)膽固醇代謝的研究目前還沒有報道。本課題在國內(nèi)外首次以木豆葉提取物為干預(yù)藥物，觀察芪類成分及其合成類似物S03、黃酮類成分調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇代謝，促進(jìn)RCT過程的機(jī)理，并探討它們抗動脈粥樣硬化形成的潛在作用。 1.木豆葉提取物及其合成類似物S03對高脂血癥模型動物血脂代謝的影響 首先通過手術(shù)去除動物卵巢的方式建立高脂血癥模型模擬絕經(jīng)后女性血脂變化，初步了解木豆葉總提取物對該模型的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)木豆葉總提取物具有降低動物血

4、脂和血糖水平的趨勢。為進(jìn)一步明確木豆葉總提取物中具有調(diào)節(jié)膽固醇代謝作用的有效成分，通過喂食高脂飼料的方式建立高脂血癥動物模型，分別給予木豆葉芪類成分和黃酮類成分，觀察兩類成分調(diào)節(jié)血脂的效應(yīng)和作用機(jī)理。研究結(jié)果表明黃酮類成分對于血脂代謝無明顯影響。而木豆葉芪類提取物卻具有明顯的血脂調(diào)節(jié)功能，能夠減輕動物體重，顯著降低高脂模型小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C水平，提高血清超氧化物歧化酶(SOD)的活力。同時芪類成分還可

5、以明顯減少肝臟中TC和TG的蓄積。為探討芪類物質(zhì)的作用機(jī)制，選擇肝臟中涉及膽固醇合成、吸收和代謝的三個關(guān)鍵蛋白-HMG-CoAR、LDL-R和CYP7A1作為觀察對象，以RT-PCR的方法檢測其表達(dá)水平。結(jié)果表明，芪類成分可以上調(diào)這三者的基因表達(dá)，通過促進(jìn)LDL-C的吸收和增加膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化來降低體內(nèi)膽固醇水平。 同時，在實驗中還觀察到芪類成分的合成類似物S03可以改善去卵巢高脂血癥模型動物的血脂代謝。去卵巢手術(shù)后動物體重和

6、血清膽固醇含量異常升高，S03可以明顯減輕去卵巢動物體重和肝臟重量，減少動物血清中TC含量和LDL-C含量。此外，S03還可以降低動物體內(nèi)卵泡刺激素(FSH)和促黃體生成素(LH)的濃度，糾正去卵巢后的性激素分泌失調(diào)。 2.木豆葉芪類單體成分C03對膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程的影響 根據(jù)前一個實驗結(jié)果，選擇芪類成分中的單體成分C03作為觀察藥物，了解其對RCT過程的影響。巨噬細(xì)胞中膽固醇通過ABCA1流出是RCT過程的起始步驟。

7、同時，由巨噬細(xì)胞大量攝取氧化低密度脂蛋白轉(zhuǎn)化成的泡沫細(xì)胞，也是動脈粥樣硬化斑塊的重要組成部分。肝臟細(xì)胞中含有的LDL-R和SR-BⅠ介導(dǎo)了RCT過程的終止步驟。本實驗確定上述在RCT過程起始和終止階段的重要功能蛋白作為觀察對象，檢測C03對膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程中ABCA1、LDL-R和SR-BⅠ蛋白功能和表達(dá)的影響，以及C03抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，減少泡沫細(xì)胞形成的效應(yīng)。 結(jié)果顯示C03可以上調(diào)巨噬細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)

8、巨噬細(xì)胞內(nèi)[3H]膽固醇的流出，有助于啟動RCT過程。同時還發(fā)現(xiàn)C03可以抑制巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白的吞噬攝取，降低細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇含量和膽固醇酯含量，進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞的形成。C03能夠顯著上調(diào)肝臟細(xì)胞中LDL-R的表達(dá)，且該作用具有劑量依賴性和時間依賴性。對于SR-BⅠ的表達(dá)，C03的作用并不明顯。研究表明C03不但可以促進(jìn)RCT過程，而且具有防治動脈粥樣硬化脂質(zhì)斑塊形成的功能，有益于減緩動脈粥樣硬化的病理改變。 此外，根

9、據(jù)已有的實驗結(jié)果，采用受體結(jié)合實驗來了解C03與肝臟雌激素受體的結(jié)合特性，觀察C03與雌激素受體結(jié)合的有關(guān)常數(shù)。為深入探討C03的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 3.木豆葉芪類成分C03及其合成類似物S03血管保護(hù)作用的初步研究 氧化損傷是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因素之一，而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能改變是動脈粥樣硬化的始動因素。本部分實驗采用過氧化氫損傷人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(EAhy926細(xì)胞)建立內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷模型，觀察C03對過

10、氧化氫損傷的拮抗作用,同時了解C03改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的效應(yīng)。結(jié)果表明C03可以降低過氧化氫對EAhy926細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞的存活率。C03抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用可能是通過提高細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶的活性，同時增加細(xì)胞的NO分泌量來達(dá)到的。 在動脈粥樣硬化形成過程中，動脈內(nèi)皮發(fā)生損傷誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖，參于炎癥反應(yīng)和斑塊纖維帽的形成。本實驗通過將C03和S03與血管平滑肌細(xì)胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，S03能夠劑量依賴性抑制

11、血管平滑肌細(xì)胞的增殖，而C03的抑制作用相對較弱，可能具有減弱血管壁增厚的潛能。 綜上所述，本課題建立了兩種不同的高脂血癥動物模型，分別驗證了木豆葉芪類成分及其合成類似物S03改善高脂血癥的療效，并探討了芪類成分降低體內(nèi)膽固醇含量的作用機(jī)理。然后通過體外細(xì)胞實驗，進(jìn)一步探討芪類成分C03對膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程的干預(yù)效果和減緩泡沫細(xì)胞形成的作用。同時，對于C03抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，以及與雌激素受體的結(jié)合特性也做了一定程度的研究