Tyro3 RTKs調(diào)節(jié)精子發(fā)生的功能研究.pdf

1、哺乳動物精子發(fā)生是一個極其復雜的、且受到嚴格調(diào)控的細胞分化過程，可以分為三個時期:有絲分裂期、減數(shù)分裂期和精子形成期。在這一過程中，精原細胞逐漸轉(zhuǎn)化成高度分化的單倍體精子，成熟的精子釋放到曲細精管管腔。曲細精管中唯一的體細胞--Sertoli細胞，和發(fā)育中的各級生精細胞始終通過細胞間的直接接觸和/或旁分泌信號途徑進行著物質(zhì)和信息的交流，且Sertoli細胞的結(jié)構(gòu)和功能隨生精周期發(fā)生著明顯的周期性波動，但是，Sertoli細胞調(diào)節(jié)精子發(fā)生

2、的分子基礎仍不是很清楚?；蚯贸夹g(shù)的出現(xiàn)，為這一領域的探究提供了新的工具。Tyro3受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases，RTKs)亞家族包括三個成員:Axl、Tyro3和Mer。雖然以前已有研究證實Tyro3RTKs三個基因同時敲除的雄性小鼠不育，但其機理未明。鑒于此，我們利用Tyro3RTKs基因敲除小鼠為模型，深入研究了Tyro3RTKs在調(diào)節(jié)精子發(fā)生中的功能，研究結(jié)果為闡明Tyro3RTKs調(diào)節(jié)精

3、子發(fā)生的機理提供了初步的實驗依據(jù)。
　　 我們對不同基因型雄性Tyro3RTKs基因敲除小鼠的生育能力進行了觀察。與正常雌性小鼠的交配實驗表明:單基因敲除小鼠(A、M和T)生育能力與正常相仿；雙基因敲除小鼠生育能力因所敲除的基因不同而異，AT型敲除小鼠的生育能力正常，但AM和MT型小鼠的生育能力均較正常明顯下降。三基因敲除的雜合體小鼠生育能力進一步下降，以aMT型與AMt型小鼠最為明顯。三基因同時敲除的TAM型小鼠完全喪失了生育

4、能力。而且，各種基因型小鼠睪丸重量/體重比值和附睪精子計數(shù)的結(jié)果顯示與其生育能力吻合。生育能力低下的基因型小鼠睪丸重量/體重比值下降，附睪精子數(shù)量減少，反之亦然。TAM型小鼠睪丸重量/體重比值降為正常的30％，附睪內(nèi)完全缺失成熟精子，出現(xiàn)大量未成熟精子。這些結(jié)果提示Tyro3RTKs亞家族的成員之間在調(diào)節(jié)精子發(fā)生上存在相互協(xié)調(diào)，Mer可能起到更重要的作用。
　　 利用半薄切片技術(shù)，我們詳細觀察了TAM雄性小鼠生后發(fā)育階段(3天、

5、1周、2周、3周、5周、8周和15周)睪丸的形態(tài)學變化，并對前3周睪丸內(nèi)精原細胞、初級精母細胞、精子細胞、支持細胞、肌樣細胞和退化的細胞進行了計數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)TAM小鼠精原細胞、支持細胞和肌樣細胞的數(shù)量沒有改變。但自2周開始，睪丸出現(xiàn)早期退化現(xiàn)象，初級精母細胞數(shù)量較正常下降，退化細胞增多，3周時改變更加明顯，而且圓形精子細胞數(shù)量也減少。這些退化現(xiàn)象隨年齡增長而不斷加劇。5周曲細精管上皮中長形精子細胞數(shù)量明顯減少，而退化細胞顯著增多，Ser

6、toli細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡；8周曲細精管中已少見長形精子細胞，且不同成熟階段的精子細胞同時出現(xiàn)于同一個曲細精管橫切面上，提示精子發(fā)生的不同步；同時可見部分殘余體脫落到管腔中。15周小鼠已基本無長形精子；Sertoli細胞空泡化、精子細胞發(fā)育不同步、發(fā)育各個階段的生精細胞脫落及合胞體形成的現(xiàn)象更加明顯；偶爾可見少量僅剩下Sertoli細胞和精原細胞的曲細精管。應用流式細胞術(shù)對小鼠睪丸內(nèi)細胞進行了核型分析，與形態(tài)學觀察的結(jié)果完全一致，TAM

7、小鼠濃縮的單倍體核顯著減少剛好對應了長形精子的嚴重缺失。這些表型清楚地反映了Sertoli細胞和生精細胞之間的連接出現(xiàn)異常，提示Tyro3RTKs可能參與介導Sertoli細胞與生精細胞之間的黏附功能。這個假說也得到了體外實驗的證實，體外培養(yǎng)的3周TAM小鼠Sertoli細胞與生精細胞的黏附能力顯著下降。
　　 本文對睪丸內(nèi)脂滴進行了分析。脂滴是Sertoli細胞胞質(zhì)中的一種重要的內(nèi)含物，其確切的功能和代謝情況目前仍不是很清楚。

8、我們采用了冰凍切片油紅O染色、結(jié)合Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)進行顯微定量分析，詳細觀察了生后發(fā)育階段到成年后小鼠睪丸中脂滴的動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sertoli細胞內(nèi)脂滴的量隨小鼠性成熟而逐漸增加，與生精細胞的發(fā)育進展呈現(xiàn)正相關(guān)，生精細胞越多，脂滴的量就越高。而且成年后小鼠睪丸曲細精管內(nèi)的脂滴可以分為兩個部分，分別位于基底部的Sertoli細胞內(nèi)和管腔部的精子細胞細胞質(zhì)葉(殘余體)中，二者的量均有與生精周期相伴的周期性改變

9、。前者IX-I期水平較高，后者Ⅶ-Ⅷ期水平較高。并且，無論是青春期還是成年后，Sertoli細胞內(nèi)脂滴的量始終與其吞噬的曲細精管內(nèi)凋亡生精細胞以及殘余體的量呈現(xiàn)非常緊密的時空相關(guān)性，提示其可以作為評價Sertoli細胞吞噬功能的指標。這一推測也得到了體外吞噬實驗的證實，與凋亡生精細胞共培養(yǎng)后，Sertoli細胞內(nèi)脂滴的量明顯增加。另外，我們還分離了各期的曲細精管，利用熒光素/熒光素酶反應體系和血小板分析儀，檢測了各期曲細精管內(nèi)ATP的含

10、量，同時利用酶組化法檢測了ATP酶的含量。我們發(fā)現(xiàn)各期曲細精管內(nèi)ATP的含量與該期Sertoli細胞內(nèi)脂滴的量成正相關(guān)，與ATP酶的量成負相關(guān)。這些結(jié)果提示Sertoli細胞內(nèi)的脂滴可用作產(chǎn)生能量的原料，為精子發(fā)生提供能量。Sertoli細胞中的脂代謝仍然值得迸一步的研究。
　　 最后，我們觀察了TAM小鼠生后發(fā)育階段到成年后睪丸內(nèi)脂滴的動態(tài)變化規(guī)律。與同年齡正常小鼠相比較，TAM小鼠Leydig細胞的脂滴含量無明顯改變，曲細精

11、管內(nèi)的脂滴卻有明顯改變。TAMSertoli細胞內(nèi)的脂滴2周時開始下降，且隨年齡增長而降低更加明顯；而且，其脂滴的含量與生精上皮的完整性成正比，破壞越嚴重的曲細精管，其內(nèi)的脂滴含量越少，反之亦然；而且脂滴含量喪失了正常的周期性變化規(guī)律，15周TAM小鼠Sertoli細胞內(nèi)脂滴含量僅為正常的13％。鑒于Sertoli細胞內(nèi)脂滴的量可以作為評價Sertoli細胞吞噬功能的指標，這些結(jié)果提示TAM小鼠Sertoli細胞的吞噬功能受損。體外吞噬

12、實驗的結(jié)果也證實了這一推論。我們還發(fā)現(xiàn)TAM小鼠曲細精管中ATP的量也降低，同時ATP酶的量增加，這與我們的推論完全一致。TAM小鼠Sertoli細胞的吞噬能力降低，導致脂滴形成減少，水解產(chǎn)生的ATP也隨之減少，為緩解能量供應的不足，ATP酶代償性的增多。
　　 結(jié)論:Sertoli細胞可能是Tyro3RTKs的直接作用靶點。Tyro3RTKs可能調(diào)節(jié)Sertoli細胞與生精細胞之間的黏附以及Sertoli細胞的吞噬功能，進而調(diào)