BCAS2在小鼠精子發(fā)生中的功能和機制研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個非常動態(tài)和復雜的過程，主要經歷三個階段:精原細胞有絲分裂、精母細胞減數(shù)分裂和精子細胞的變形，最終產生單倍體長形精子。精子發(fā)生的每個階段都需要基因表達的精確調控?？勺兗艚幼鳛榉浅Ｖ匾幕蜣D錄后調控方式，極大的增加了高等真核生物和復雜器官中轉錄和翻譯產物的多樣性。大量研究數(shù)據(jù)顯示可變剪接調控了精子發(fā)生相關基因的表達和功能;此外，很多剪接因子在睪丸中呈現(xiàn)細胞或發(fā)育階段特異性表達模式，這都說明可變剪接可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重

2、要的調控功能。BCAS2(breast carcinoma amplifiedsequence2)是Prp19相關復合體的核心組分，參與了前體RNA的剪接等重要生命活動。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)BCAS2在雄性生殖細胞中具有特異性表達模式。本課題采用精原干細胞特異性敲除BCAS2的小鼠模型，研究BCAS2是否參與精子發(fā)生過程中的剪接。
　　通過對BCAS2在睪丸發(fā)育過程中的免疫染色觀察和生精細胞的富集，發(fā)現(xiàn)BCAS2在小鼠睪丸的精原干細

3、胞中相對高表達。Vasa-Cre介導生殖細胞特異性敲除BCAS2的雄性小鼠生長正常，具有正常的交配行為，但不能生育后代;進一步檢測發(fā)現(xiàn)，BCAS2缺失導致精子發(fā)生明顯異常，表現(xiàn)為減數(shù)第一次分裂前期的生殖細胞數(shù)目明顯下調，并且基本觀察不到減數(shù)分裂的關鍵事件（重組和聯(lián)會）。通過對精原干細胞的數(shù)量、定位、增殖和凋亡進行染色和統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，BCAS2缺失的睪丸中精原干細胞發(fā)育基本正常，但減數(shù)第一次分裂前期的精母細胞大量缺失，減數(shù)分裂啟動的關鍵因子S

4、TRA8的表達也明顯下調，說明BCAS2缺失的睪丸無法正常啟動減數(shù)分裂。為了進一步解析BCAS2的作用機制，我們對出生后第9天(P9)的正常和BCAS2敲除的小鼠睪丸進行了RNA深度測序分析。結果發(fā)現(xiàn)BCAS2缺失的睪丸轉錄組水平的基因表達基本正常。但是作為剪接目標基因tubulin的表達明顯變化，提示BCAS2可能通過剪接發(fā)揮功能。為了研究BCAS2在pre-mRNA剪接方面的功能，我們進一步研究了BCAS2缺失睪丸中的可變剪接的變化

5、。結果顯示，在BCAS2缺失的睪丸中有245個基因的可變剪接發(fā)生了異常，其中包括6個在精子發(fā)生中具有重要功能的基因（Dazl、Ehmt2、Hmga1、Cit、Hsf1和Bcl2l11）。利用半定量RT-PCR和real-time RT-PCR，我們成功驗證出Dazl、Ehmt2和Hmga1的可變剪接異常。此外，BCAS2的缺失會導致“減數(shù)分裂促進因子”DAZL不同轉錄本的表達異常:全長形式的轉錄本顯著性下調，而缺失8號外顯子的轉錄本表達