左歸丸含藥血清促進(jìn)大鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：研究左歸丸含藥血清對(duì)骨髓間質(zhì)細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的影響，探討中醫(yī)補(bǔ)腎生髓成肝的機(jī)制，為促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為補(bǔ)腎治療肝病的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 方法：體外培養(yǎng)Wister大鼠肝組織塊，收集其培養(yǎng)上清即為條件培養(yǎng)液。取Wister大鼠，隨機(jī)分組后分別用生理鹽水、中藥左歸丸濃縮煎劑、中藥八珍湯濃縮煎劑以10ml/kg的量灌胃，持續(xù)15天，第15天灌胃后2小時(shí)，頸動(dòng)脈插管取血，離心后獲得正常大鼠血清、左歸

2、丸含藥血清、八珍湯含藥血清。采用貼壁分離，連續(xù)傳代培養(yǎng)的方法純化Wister大鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞，反復(fù)傳代后分為6組。常規(guī)培養(yǎng)組始終使用常規(guī)培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液+體積分?jǐn)?shù)20％胎牛血清+2mmol/L谷氨酸胺)進(jìn)行培養(yǎng)；HGF誘導(dǎo)組以常規(guī)培養(yǎng)液+促肝細(xì)胞生長因子(HGF，25ng/ml)和地塞米松(10-7M)進(jìn)行培養(yǎng)；HGF加左歸丸組以常規(guī)培養(yǎng)液+促肝細(xì)胞生長因子(HGF，25ng/ml)和地塞米松(10-7M)+10％的左歸丸含藥血清

3、進(jìn)行培養(yǎng)；條件培養(yǎng)液加對(duì)照血清組以常規(guī)培養(yǎng)液+50％的條件培養(yǎng)液+10％正常大鼠血清進(jìn)行培養(yǎng)；條件培養(yǎng)液加八珍湯組以常規(guī)培養(yǎng)液+50％的條件培養(yǎng)液+10％八珍湯含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)；條件培養(yǎng)液加左歸丸組以常規(guī)培養(yǎng)液+50％的條件培養(yǎng)液+10％左歸丸含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)28天，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化并于培養(yǎng)第0、7、14、21、28天時(shí)留取細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測肝細(xì)胞表面標(biāo)記CK18、AFP、ALB的表達(dá)，PAS染色檢測糖原的表達(dá)

4、。各標(biāo)本在統(tǒng)一放大倍數(shù)(400×)下，隨機(jī)選取數(shù)個(gè)視野，數(shù)陽性與陰性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率，比較不同培養(yǎng)組之間差異，兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果：誘導(dǎo)后約3天左右即有少量細(xì)胞形態(tài)開始變化，表現(xiàn)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)；7～8天呈多邊形，胞漿豐富，核大；10天左右與肝細(xì)胞體外貼壁形態(tài)幾乎一樣。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，肝細(xì)胞樣的細(xì)胞數(shù)量也漸增多。誘導(dǎo)后28天，肝細(xì)胞樣的細(xì)胞仍存活。對(duì)照組的細(xì)胞仍然呈梭形，傳代至15代時(shí)細(xì)胞開始變得寬大、

5、扁平，逐漸脫壁死亡。左歸丸含藥血清能促進(jìn)這一誘導(dǎo)作用，與對(duì)照組比較，在誘導(dǎo)后7、14、21、28天，肝細(xì)胞樣的細(xì)胞數(shù)量有顯著增加的同時(shí)，其形態(tài)更接近正常肝細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)組細(xì)胞僅見極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)AFP及ALB，各時(shí)間點(diǎn)比較陽性細(xì)胞率無顯著差異。HGF誘導(dǎo)組、HGF加左歸丸組、條件培養(yǎng)液加對(duì)照血清組、條件培養(yǎng)液加八珍湯組、條件培養(yǎng)液加左歸丸組等實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞0天時(shí)AFP、ALB僅極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)，CK18及糖原未見表達(dá)；其總體趨勢表現(xiàn)為，AFP在

6、7天時(shí)表達(dá)明顯升高，14、21天時(shí)表達(dá)又快速減弱，28天時(shí)僅少數(shù)細(xì)胞表達(dá)；CK18、ALB及糖原在7天時(shí)少量表達(dá)，14、21、28天時(shí)表達(dá)明顯逐漸升高。誘導(dǎo)7天時(shí)，其AFP陽性細(xì)胞率HGF誘導(dǎo)組(63.2±2.6)、HGF加左歸丸組(78.9±3.1)、條件培養(yǎng)液加八珍湯組(43.0±2.3)和條件培養(yǎng)液加左歸丸組(82.5±3.0)，以上各含左歸丸藥物血清實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異顯著(P＜0.05)。誘導(dǎo)28天時(shí)，HGF誘導(dǎo)組其陽性細(xì)

7、胞率(％)CK18(60.7±2.3)、ALB(61.3±2.6)、糖原(52.6±2.7)；HGF加左歸丸組其陽性細(xì)胞率(％)CK18(72.6±2.7)，ALB(78.8±3.4)、糖原(69.2±2.8)；條件培養(yǎng)液加八珍湯組其陽性細(xì)胞率(％)CK18(62.8±2.3)，ALB(60.5±2.3)、糖原(59.8±2.4)；條件培養(yǎng)液加左歸丸組其陽性細(xì)胞率(％)CK18(82.2±2.9)，ALB(89.0±2.9)、糖原(89