復(fù)合成骨誘導(dǎo)劑促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過不同濃度的阿侖膦酸鈉(Alendronate，ALN)與相同濃度的常規(guī)成骨誘導(dǎo)劑（10-8mol/L地塞米松，10.0mmol/Lβ-甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸）作用于大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow StromalStem Cells，BMSCs)，研究ALN是否具有增強(qiáng)常規(guī)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，同時(shí)研究在何種濃度下增強(qiáng)效應(yīng)最理想，以此來探討作為在骨組織工程中的種子細(xì)胞來源之一的BM

2、SCs如何在體外能高效的分化為成骨細(xì)胞，并觀察其成骨過程中BMP-2的表達(dá)，為以后臨床修復(fù)研究提供基礎(chǔ)性準(zhǔn)備。
　　方法:取2只2月齡的雄性SD大鼠，將其脫頸處死消毒后在超凈工作臺內(nèi)解剖出四肢的股骨、脛骨并獲其骨髓，采用密度梯度離心法并結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠BMSCs，制備出BMSCs的單細(xì)胞懸液。接種于含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基中，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步去除未貼壁的干細(xì)胞及其他細(xì)胞等，待細(xì)胞貼壁達(dá)到培養(yǎng)瓶底80％

3、左右時(shí)，加入0.25％的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取生長良好的第3代對數(shù)期細(xì)胞，以1×106/L的細(xì)胞濃度進(jìn)行CD44，CD45表型鑒定以確定所得的細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)繪制細(xì)胞生長曲線圖。將已進(jìn)行鑒定的細(xì)胞以1×108/L的細(xì)胞濃度分為7個(gè)組分別為A-G，A組作為對照組，繼續(xù)加入含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);B組加入含有常規(guī)誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基（10-8mol/L地塞米松，10.0mmol/Lβ-甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸

4、）進(jìn)行培養(yǎng);C組中加入含常規(guī)誘導(dǎo)劑及10-6mol/L ALN的培養(yǎng)基;D、E、F、G組分別在C組的基礎(chǔ)上將ALN的濃度分別改為10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L并加入，以上組均持續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)液，同時(shí)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖及形態(tài)變化，培養(yǎng)1、2、3周后分別用western-blot法檢測細(xì)胞中BMP-2的表達(dá)并用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:用梯度離心法結(jié)合貼

5、壁法進(jìn)行培養(yǎng)可以獲得高純度的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞在接種后48h出現(xiàn)貼壁，其形態(tài)出現(xiàn)多樣性如橢圓形、多角形以及短梭形;約72h后細(xì)胞則出現(xiàn)散在的紡錘狀并貼壁生長，10-14天后形成增殖。BMSCs貼壁早期排列較為疏松、紊亂，約3周后貼壁細(xì)胞變得致密。經(jīng)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞得到進(jìn)一步純化，其形態(tài)為均一的長梭形并呈漩渦狀排列，而且生長速率加快。生長曲線顯示:培養(yǎng)第4d起細(xì)胞呈對數(shù)生長，約第7d達(dá)到高峰，之后轉(zhuǎn)為平臺期。流式細(xì)胞儀檢測CD44陽性

6、表達(dá)率93.9％， CD45陽性表達(dá)率為5.5％。在加入不同濃度的單一或混合誘導(dǎo)劑后每周觀察發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞存活良好且E組中細(xì)胞變得肥大、多角，且周圍分泌物較其他組明顯增多，A組中細(xì)胞發(fā)生變化的數(shù)量最少，分泌物明顯最低，3個(gè)不同時(shí)期采用western-blot檢測發(fā)現(xiàn)BMP-2表達(dá)量順序均如下:E＞D＞F＞C＞G＞B＞A。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1.采用梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法可以獲得純化的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。2.ALN與常規(guī)誘導(dǎo)