真核生物AU-rich元件結(jié)合蛋白HuR和GAPDH3的結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、一、人源mRNA穩(wěn)定蛋白HuR的結(jié)構(gòu)與功能研究
　　 哺乳動物細胞中，mRNA的降解受到精確調(diào)控，這一調(diào)控機制需要順式作用元件和反式作用因子的相互作用。其中研究得最詳細的順式作用元件是位于mRNA3'-非編碼區(qū)的富含AU序列的元件（ARE）。這一序列元件最顯著的一個特征就是具有數(shù)目和分布不等的AUUUA五聯(lián)體核苷酸。目前已經(jīng)鑒定出二十多種結(jié)合ARE的蛋白，包括本篇論文的研究對象HuR(human antigen R)。HuR蛋白

2、屬于脊椎動物Hu家族成員，該家族蛋白還包括HuB、HuC和HuD。HuR分子量約為36 kDa，它的表達不具有組織特異性。這個蛋白含有三個RNA識別基序（RRM），其中N端兩個串聯(lián)的RRM結(jié)構(gòu)域（RRM1/2）可以以高親和力結(jié)合ARE，而位于C端的第三個RRM結(jié)構(gòu)域則可以結(jié)合poly(A)尾巴和其他的蛋白配體。HuR被認作是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白而受到越來越多的關(guān)注。小角散射實驗(SAXS)結(jié)果顯示HuR的構(gòu)象在結(jié)合底物RNA前后發(fā)生

3、了很大的變化。但迄今為止還沒有晶體結(jié)構(gòu)從細節(jié)上驗證這一結(jié)果。故研究HuRRRM1/2識別底物RNA的分子機制具有其實際意義。
　　 本論文中，我們解析了HuR RRM1/2無底物狀態(tài)時的晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一種開放的構(gòu)象，兩個RRM結(jié)構(gòu)域之間不存在任何相互作用。突變實驗證實HuR RRM1/2與其他RRM結(jié)構(gòu)域一樣也是通過它的β片結(jié)合RNA的。我們同時也解析了HuR RRM1/2結(jié)合11個堿基RNA(5'-AUUUUUAUUUU

4、-3')復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)則是一種閉合的狀態(tài)。RRM1/2通過一個堿性的溝槽結(jié)合底物RNA。熒光偏振實驗結(jié)果顯示RRM1是最主要的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過結(jié)合自由能分析以及熒光偏振的實驗結(jié)果分析，我們得出這樣的推論，RRM1首先結(jié)合了底物RNA，隨之HuR RRM1/2構(gòu)象發(fā)生巨大變化，這樣的變化使得RRM2和RRM1/2之間的linker提供更多的與RNA結(jié)合的接觸面積，以此大大增強了HuR與RNA的親和力。
　　

5、 二、釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶3(GAPDH3)的結(jié)構(gòu)與功能研究
　　 糖酵解途徑是細胞產(chǎn)生ATP的重要方式。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，EC∶1.2.1.12)是糖酵解過程中一個關(guān)鍵的酶。在無機磷酸和輔因子NAD+存在時，GAPDH將底物甘油醛-3-磷酸(GAP)轉(zhuǎn)化成1，3-二磷酸甘油酸。GAPDH的分子量約為37 kDa，主要存在于細胞質(zhì)中，也可以在不同細胞器之間穿梭。近些年來越來越多的實驗證據(jù)顯示GAPDH

6、具有多種糖酵解過程外的功能。例如:DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡、膜融合、tRNA轉(zhuǎn)運以及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等。已經(jīng)有多個物種的GAPDH的晶體結(jié)構(gòu)得到解析，但是關(guān)于GAPDH識別RNA的分子機制還不是很清楚。釀酒酵母中一共存在三個異構(gòu)體形式的GAPDH:GAPDH1、GAPDH2和GAPDH3。之前的研究表明酵母中只有堿性最強的異構(gòu)體(GAPDH1)具有結(jié)合poly(U)的能力。但是我們通過熒光偏振實驗顯示其中偏酸性的異構(gòu)體GAPDH3也具

7、有結(jié)合RNA的能力。
　　 為了研究GAPDH3結(jié)合RNA的分子機制，我們解析了GAPDH3的晶體結(jié)構(gòu)。釀酒酵母的GAPDH3與其他物種的GAPDH具有十分相似的總體結(jié)構(gòu):NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基1-149）和催化結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基150-332）。溶液狀態(tài)下GAPDH3以同源四聚體的形式存在。酶活實驗結(jié)果顯示，GAPDH3對于NAD+的表觀米氏常數(shù)約為682μM。熒光偏振實驗結(jié)果表明GAPDH3可以結(jié)合mRNA(5'-A