真核生物AU-rich元件結(jié)合蛋白HuR和GAPDH3的結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、一、人源mRNA穩(wěn)定蛋白HuR的結(jié)構(gòu)與功能研究
　　 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，mRNA的降解受到精確調(diào)控，這一調(diào)控機(jī)制需要順式作用元件和反式作用因子的相互作用。其中研究得最詳細(xì)的順式作用元件是位于mRNA3'-非編碼區(qū)的富含AU序列的元件（ARE）。這一序列元件最顯著的一個(gè)特征就是具有數(shù)目和分布不等的AUUUA五聯(lián)體核苷酸。目前已經(jīng)鑒定出二十多種結(jié)合ARE的蛋白，包括本篇論文的研究對象HuR(human antigen R)。HuR蛋白

2、屬于脊椎動(dòng)物Hu家族成員，該家族蛋白還包括HuB、HuC和HuD。HuR分子量約為36 kDa，它的表達(dá)不具有組織特異性。這個(gè)蛋白含有三個(gè)RNA識(shí)別基序（RRM），其中N端兩個(gè)串聯(lián)的RRM結(jié)構(gòu)域（RRM1/2）可以以高親和力結(jié)合ARE，而位于C端的第三個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域則可以結(jié)合poly(A)尾巴和其他的蛋白配體。HuR被認(rèn)作是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白而受到越來越多的關(guān)注。小角散射實(shí)驗(yàn)(SAXS)結(jié)果顯示HuR的構(gòu)象在結(jié)合底物RNA前后發(fā)生

3、了很大的變化。但迄今為止還沒有晶體結(jié)構(gòu)從細(xì)節(jié)上驗(yàn)證這一結(jié)果。故研究HuRRRM1/2識(shí)別底物RNA的分子機(jī)制具有其實(shí)際意義。
　　 本論文中，我們解析了HuR RRM1/2無底物狀態(tài)時(shí)的晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一種開放的構(gòu)象，兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域之間不存在任何相互作用。突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)HuR RRM1/2與其他RRM結(jié)構(gòu)域一樣也是通過它的β片結(jié)合RNA的。我們同時(shí)也解析了HuR RRM1/2結(jié)合11個(gè)堿基RNA(5'-AUUUUUAUUUU

4、-3')復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)則是一種閉合的狀態(tài)。RRM1/2通過一個(gè)堿性的溝槽結(jié)合底物RNA。熒光偏振實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RRM1是最主要的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過結(jié)合自由能分析以及熒光偏振的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，我們得出這樣的推論，RRM1首先結(jié)合了底物RNA，隨之HuR RRM1/2構(gòu)象發(fā)生巨大變化，這樣的變化使得RRM2和RRM1/2之間的linker提供更多的與RNA結(jié)合的接觸面積，以此大大增強(qiáng)了HuR與RNA的親和力。
　　

5、 二、釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶3(GAPDH3)的結(jié)構(gòu)與功能研究
　　 糖酵解途徑是細(xì)胞產(chǎn)生ATP的重要方式。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，EC∶1.2.1.12)是糖酵解過程中一個(gè)關(guān)鍵的酶。在無機(jī)磷酸和輔因子NAD+存在時(shí)，GAPDH將底物甘油醛-3-磷酸(GAP)轉(zhuǎn)化成1，3-二磷酸甘油酸。GAPDH的分子量約為37 kDa，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可以在不同細(xì)胞器之間穿梭。近些年來越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示GAPDH

6、具有多種糖酵解過程外的功能。例如:DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、膜融合、tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等。已經(jīng)有多個(gè)物種的GAPDH的晶體結(jié)構(gòu)得到解析，但是關(guān)于GAPDH識(shí)別RNA的分子機(jī)制還不是很清楚。釀酒酵母中一共存在三個(gè)異構(gòu)體形式的GAPDH:GAPDH1、GAPDH2和GAPDH3。之前的研究表明酵母中只有堿性最強(qiáng)的異構(gòu)體(GAPDH1)具有結(jié)合poly(U)的能力。但是我們通過熒光偏振實(shí)驗(yàn)顯示其中偏酸性的異構(gòu)體GAPDH3也具

7、有結(jié)合RNA的能力。
　　 為了研究GAPDH3結(jié)合RNA的分子機(jī)制，我們解析了GAPDH3的晶體結(jié)構(gòu)。釀酒酵母的GAPDH3與其他物種的GAPDH具有十分相似的總體結(jié)構(gòu):NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基1-149）和催化結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基150-332）。溶液狀態(tài)下GAPDH3以同源四聚體的形式存在。酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GAPDH3對于NAD+的表觀米氏常數(shù)約為682μM。熒光偏振實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GAPDH3可以結(jié)合mRNA(5'-A