嗜肺軍團菌類真核效應蛋白的系統(tǒng)發(fā)生及生物學功能研究.pdf

1、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)是引起嚴重非典型肺炎——軍團病和龐蒂亞克熱的胞內(nèi)致病菌。該菌廣泛地生活在水生環(huán)境中或寄生在原生動物體內(nèi)。當人體吸入含有嗜肺軍團菌的氣溶膠后，該菌能到達肺部，在肺泡巨噬細胞中增殖進而導致疾病的產(chǎn)生。嗜肺軍團菌成功胞內(nèi)增殖的關鍵在于它能通過IVB型分泌系統(tǒng)分泌大量的效應蛋白到宿主細胞內(nèi)，使其躲避宿主細胞早期溶酶體途徑的傷害，同時操縱宿主細胞的小泡運輸途徑，募集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡、線粒體和核糖

2、體等細胞器修飾利于嗜肺軍團菌增殖的的空泡(LCV)。近年來，多項研究致力于揭示嗜肺軍團菌效應蛋白的功能，但由于大部分效應蛋白具有功能冗余性的特征并且缺乏有效的檢測手段，目前對這些效應蛋白的功能還知之甚少。遺傳背景清楚、細胞途徑保守的真核模式生物釀酒酵母和研究蛋白與蛋白相互作用的GSTpull-down技術為效應蛋白的研究提供了新的途徑。
　　 本文對嗜肺軍團菌編碼3個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、鞘氨醇-1-磷酸裂解酶I和類酸性神經(jīng)磷

3、脂酶的磷酸二酯酶的基因及其編碼的蛋白進行生物信息學分析，探討其系統(tǒng)發(fā)生。分析結果表明：這5個基因是嗜肺軍團菌通過基因水平轉(zhuǎn)移(HGT)的方式從其它物種獲取而來的，其中編碼的蛋白LegK1、LegK3很有可能直接源自原生動物。半定量RT-PCR結果表明lpg2137和lpg2556在指數(shù)生長后期大量表達，而lpg2588和lpg2176在指數(shù)生長前期大量表達，分別提示他們在感染期和復制期發(fā)揮功能。
　　 利用釀酒酵母作為替代宿主的

4、生長抑制實驗表明，在37℃生長條件下，用低拷貝質(zhì)粒在酵母細胞中表達LegK3引起了較弱的酵母生長抑制現(xiàn)象。在酵母細胞內(nèi)的共定位分析發(fā)現(xiàn)，LegK3與肌動蛋白細胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的小泡均出現(xiàn)了共定位現(xiàn)象，表明LegK3在酵母細胞內(nèi)的靶標可能是細胞骨架和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運小泡。
　　 通過大腸桿菌BL21(DE3)成功表達GST-LegK1、GST-LegK2、GST-LegK3和GST-LegS1，并純化得到GST-Le

5、gK2、GST-LegK3和GST-LegS1。以GST-LegK3為誘餌蛋白，通過GST pull-down從人肺泡巨噬細胞U937細胞總蛋白中篩選到一個靶標蛋白，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定為肌動蛋白，進一步證實了LegK3的靶標是細胞骨架。
　　 此外，本文還對嗜肺軍團菌的一個LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子lpg0173與抗氧化功能、上游基因的調(diào)控關系、以及對嗜肺軍團菌胞內(nèi)增殖能力和細胞毒性的影響進行研究。結果表明，野生型Lp