NONO蛋白與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病關(guān)系的臨床研究.pdf

1、背景
　　 目前，全世界每年約有2千萬(wàn)人死于急性心血管事件，其中有一半以上為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高、飲食習(xí)慣的改變以及生活壓力的增大，冠心病表現(xiàn)出年輕化、高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。故而，對(duì)其進(jìn)行深入研究，以期開(kāi)發(fā)早期診斷和早期治療的具體措施具有重要的科學(xué)和臨床意義。當(dāng)前，尋找冠心病的早期預(yù)警指標(biāo)，使其防患于未然，也成為當(dāng)今冠心病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 冠心病的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)

2、為冠狀動(dòng)脈的粥樣硬化斑塊形成，而斑塊的穩(wěn)定性改變是急性心血管事件發(fā)生的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性主要依賴于細(xì)胞外基質(zhì)的支持，其中最主要的成分是膠原纖維，主要分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。膠原代謝主要是由膠原的合成與降解維持相對(duì)平衡來(lái)調(diào)節(jié)的。4羥基-脯氨酸羥化酶(P4H)包括2個(gè)α亞基(P4Hα1，P4Hα2)和2個(gè)β亞基(P4Hβ1，P4Hβ2)，兩者構(gòu)成四聚體，是膠原合成過(guò)程中的重要限速酶。P4H過(guò)表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致膠原合成增多，而抑制了P

3、4H的產(chǎn)生，則可導(dǎo)致膠原代謝的不穩(wěn)定和降解。我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn):TNF-α通過(guò)作用于ASK1-MKK4-JNK1-NONO這條信號(hào)通路，抑制了P4Hα1的表達(dá)，從而抑制了膠原的生成;敲除NONO蛋白之后，60％以上的TNFα對(duì)P4Hα1mRNA的抑制作用消失。這表明，NONO蛋白在膠原的合成的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，并有可能參與斑塊易損性的調(diào)節(jié)。
　　 本研究中，擬通過(guò)分析穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者外周

4、血中NONO蛋白的表達(dá)水平，明確該蛋白在冠心病發(fā)病過(guò)程中的作用，并進(jìn)而通過(guò)分析其在不同患者的表達(dá)差異，評(píng)價(jià)其作為早期預(yù)警指標(biāo)的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 目的
　　 (1)明確NONO蛋白在不同冠心病人群中的表達(dá)差異，以評(píng)價(jià)其作為早期預(yù)警指標(biāo)的可行性。
　　 (2)明確NONO蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損中作用的分子機(jī)制。
　　 方法
　　 1病例資料的收集
　　 收集病人和正常人的外周靜脈血標(biāo)本

5、120例，其中男性72例，女性48例。年齡年齡38～73歲，平均55歲，分成4組:正常組30例，急性心肌梗死組30例，不穩(wěn)定型心絞痛組30例，穩(wěn)定型心絞痛組30例。入選標(biāo)準(zhǔn):正常組為經(jīng)系統(tǒng)查體和冠狀動(dòng)脈CT檢查排除冠心病的正常人;冠心病患者按照世界衛(wèi)生組織WHO的冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組。
　　 2血中單核細(xì)胞的分離
　　 所有患者均采集肘靜脈血10ml，入EDTA抗凝管，用等體積的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)

6、2-3個(gè)小時(shí)，顯微鏡下觀察到的貼壁細(xì)胞80％為單個(gè)核細(xì)胞。
　　 3免疫熒光染色
　　 在分離出來(lái)的單核細(xì)胞中，分別加入一抗和熒光標(biāo)記二抗，在激光共聚焦下觀察NONO蛋白在細(xì)胞中的位置。
　　 4實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)
　　 通過(guò)RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)NONO蛋白在不同組之間mRNA水平的表達(dá)。
　　 5WesternBlot
　　 通過(guò)提取蛋白，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，標(biāo)記一

7、抗和二抗，顯色等步驟觀察NONO在不同組之間蛋白水平的表達(dá)。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有的數(shù)據(jù)均采用mean±SEM表示。采用SPSS13.0分析軟件，計(jì)量資料應(yīng)用方差分析，三組以上均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)行兩兩比較Newman-Keuls(SNK)/q檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1一般資料:收集正常人和患者的血糖、血脂、血壓、心肌酶、吸煙情況等資料。急性心肌梗死組患者的

8、血清中心肌酶的指標(biāo)均增高;四組患者的吸煙史差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常組相比較，急性心梗組的甘油三酯和LDL明顯升高，不穩(wěn)定組的LDL升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;急性心梗組和不穩(wěn)定心絞痛組的的收縮壓、舒張壓較正常組明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;急性心梗組的甘油三酯水平明顯高于不穩(wěn)定組和穩(wěn)定組，急性組的LDL水平明顯高于穩(wěn)定組(P均＜0.05)。其余組間數(shù)據(jù)，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2免疫熒光染色:在激光共聚焦顯微鏡下觀察，正常組和疾病組

9、單核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)都有NONO蛋白的表達(dá)。
　　 3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè):與正常組相比較，疾病組NONO蛋白mRNA水平表達(dá)均有不同程度的增高，其中，不穩(wěn)定型心絞痛組NONO蛋白的mRNA水平表達(dá)增高最明顯(P＜0.01)，其次是急性心肌梗死組(P＜0.05);不穩(wěn)定型心絞痛組與穩(wěn)定型心絞痛組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其他組間mRNA表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(圖3:單因素方差分析，F(xiàn)3.167，df3，75，P＜0.0

10、5)。
　　 4Western-Blot檢測(cè):與正常組相比較，不穩(wěn)定型心絞痛組NONO蛋白的表達(dá)量明顯增高(P＜0.05)，其他組間NONO蛋白的表達(dá)差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(圖4:單因素方差分析，F(xiàn)3.154，df3，40，P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 (1)NONO蛋白在不穩(wěn)定型心絞痛組的表達(dá)顯著增高，提示NONO蛋白可以作為心肌梗死前的預(yù)警指標(biāo)。
　　 (2)NONO蛋白在不穩(wěn)定型心絞痛組和