丙烯腈生物膜毒性致?lián)p機(jī)制的研究.pdf

1、目的：丙烯腈(acrylonitrile,ACN)，是一種無色、具苦杏仁味的高毒類腈化物，是合成樹脂、合成纖維、合成橡膠等高分子材料生產(chǎn)中的重要原料，其制成品在日常生活和生產(chǎn)過程中使用廣泛；電腦、電視、汽車等相關(guān)行業(yè)對ACN的需求量不斷增加，近年來的生產(chǎn)量和需求量逐年上升，職業(yè)接觸人群也迅速擴(kuò)大。眾多實(shí)驗(yàn)表明ACN具有多方面的毒性效應(yīng)，可引起肝臟、血液、神經(jīng)、消化道和生殖系統(tǒng)等損害，是確定的動(dòng)物致癌物，是致突變劑和潛在的人致癌劑。本研究

2、旨在探討體外細(xì)胞的增殖、胞漿鈣離子濃度、線粒體膜電位、膜完整性及凋亡在ACN毒性中的變化，以及這些指標(biāo)變化間的關(guān)聯(lián)，為丙烯腈毒理學(xué)的研究提供一定的依據(jù)。 方法：通過MTT比色法和臺盼蘭拒染法檢測不同濃度ACN作用于V79細(xì)胞(中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞)不同時(shí)間后細(xì)胞存活率的變化，了解濃度.時(shí)間.毒性效應(yīng)之間的關(guān)系；用電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；采用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦技術(shù)，通過相應(yīng)的熒光探針檢測不同濃度ACN對V79細(xì)胞作用不

3、同時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子超載情況(用熒光探針Fluo-3/AM)、細(xì)胞膜通透性(用熒光試劑碘化丙啶，PI)、線粒體膜電位的變化(熒光探針羅丹明-123,JC-1)；用AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：丙烯腈從8μmol/L(作用4h)開始即對V79細(xì)胞生長產(chǎn)生明顯抑制作用，細(xì)胞存活率呈濃度-時(shí)間依賴性，臺盼蘭拒染法和MTT比色法檢測的毒性作用效應(yīng)譜不完全一致。ACN染毒12h、2

4、4h后透射電鏡觀察顯示，在8～1000μmol/L組細(xì)胞膜未見明顯破損，在5000μmol/L組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改變，細(xì)胞膜、核膜不完整，線粒體內(nèi)膜嵴消失，只留線粒體輪廓，可見明顯腫脹伴脊氣球樣變，排列混亂，同時(shí)伴有大量脂滴聚集，膜明顯破損；流式細(xì)胞儀檢測顯示，在染毒4h、12h、24h時(shí)，PI著色率在8～1000μmol/L組均很低(<5％)，在5000μmol/L組陡然上升；在設(shè)置的4個(gè)濃度范圍內(nèi)，胞內(nèi)Ca2+濃度隨ACN濃度的增加

5、而增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；線粒體膜電位水平隨ACN濃度的增加逐漸降低(P<0.05)，呈濃度依賴關(guān)系；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法顯示，丙烯腈對V79細(xì)胞有促凋亡作用。 結(jié)論：本研究結(jié)果顯示，①在體外培養(yǎng)條件下，ACN可以明顯抑制V79細(xì)胞的增殖并呈濃度依賴關(guān)系；MTT法和臺盼藍(lán)拒染法的毒性效應(yīng)譜不完全一致。②透射電鏡觀察可見高濃度丙烯腈(5000μmol/L)可引起V79細(xì)胞膜完整性的改變；中低濃度組

6、(≤1000μmol/L)透射電鏡下未見細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)明顯變化的跡象，卻可見PI染色。提示PI染色在觀察生物膜損傷方面的敏感性要高于電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。③流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，ACN可誘導(dǎo)V79細(xì)胞漿游離Ca2+濃度持續(xù)性升高，且Ca2+濃度的變化幅度比線粒體膜電位的變化幅度大，可能敏感性更高。但增加的Ca2+是來自胞外鈣，還是來自胞內(nèi)鈣庫如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒的釋放有待進(jìn)一步探討。④流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦技術(shù)檢測結(jié)果顯示，V79細(xì)胞膜電位顯著降

7、低發(fā)生在40μmol/L丙烯腈用藥后12h；而Annexin V檢測凋亡指標(biāo)發(fā)生顯著性改變在200μmol/L作用12h以后；丙烯腈誘導(dǎo)V79細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜電位降低早于Annexin V凋亡檢測指標(biāo)，因此推測細(xì)胞膜電位崩潰發(fā)生在磷脂酰絲氨酸外翻之前，是線粒體凋亡通路的上游事件。⑤研究結(jié)果提示，ACN具有膜毒性，可誘導(dǎo)細(xì)胞膜對Ca2+的通透性增加，致使胞內(nèi)離子濃度發(fā)生改變，進(jìn)而使依賴膜內(nèi)外兩側(cè)電位差存在的跨膜電位發(fā)生變化，胞漿鈣離子、膜