兩種不同類(lèi)型微生物源示蹤技術(shù)的比較與應(yīng)用.pdf

1、微生物源示蹤技術(shù)(Microbialsourcetracking，MST)是一種以環(huán)境微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)為理論依據(jù)，用分子和生化的手段，分析糞便指示因子的特異性指紋圖譜，進(jìn)而確定水體中以糞便污染為主的非點(diǎn)源污染來(lái)源的新技術(shù)。它不僅能夠正確地識(shí)別受糞便污染水體的真正污染來(lái)源，還能評(píng)價(jià)各已知污染源的污染貢獻(xiàn)率，被專(zhuān)家們認(rèn)為將成為治理非點(diǎn)源糞便污染的有力工具。本課題基于REP-PCR技術(shù)，對(duì)庫(kù)依賴(lài)與非庫(kù)依賴(lài)微生物源示蹤技術(shù)進(jìn)行比較與應(yīng)用

2、。通過(guò)實(shí)踐與總結(jié)，為進(jìn)一步的研究以及國(guó)家管理部門(mén)監(jiān)測(cè)與管理非點(diǎn)源糞便污染提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 采集大連與濟(jì)南糞便樣本進(jìn)行庫(kù)依賴(lài)與非庫(kù)依賴(lài)微生物源示蹤，從而比較兩種類(lèi)型微生物源示蹤技術(shù)的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。為驗(yàn)證該方法受地理性差異的影響，采集濟(jì)南水體樣本進(jìn)行庫(kù)依賴(lài)與非庫(kù)依賴(lài)微生物源示蹤，對(duì)不同污染來(lái)源貢獻(xiàn)率進(jìn)行評(píng)價(jià)，檢驗(yàn)兩種方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法:
　　 本課題以大連和濟(jì)南為采樣點(diǎn)，采用

3、無(wú)菌操作采集雞、犬、牛、豬、人五種來(lái)源糞便樣本，以及濟(jì)南水體樣本，并選用大腸桿菌(E.coli)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922為對(duì)照。采用伊紅美藍(lán)(EMB)鑒別試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMVIC試驗(yàn)，對(duì)樣本中E.coli進(jìn)行分離與鑒定。采用EasyPureGenomicDNAExtractionKit試劑盒提取DNA，并用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定OD600、OD260、OD280鑒定DNA純度。從而保證為REP-PCR(細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR)擴(kuò)

4、增提供足夠DNA模板。采用REP-PCR技術(shù)對(duì)所提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并使用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gelimageanalysissystem，美國(guó)UVP公司)采集DNA指紋圖譜。采用ALPHAVIEW軟件將采集的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化為數(shù)字化的DNA指紋圖譜，其中包含條帶位置、大小、相對(duì)亮度、灰度、面積等信息。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)字化的DNA指紋圖譜進(jìn)行源示蹤，對(duì)DNA指紋圖譜進(jìn)行庫(kù)依賴(lài)與非庫(kù)依賴(lài)微生物源示蹤，比較相同地區(qū)、不同地區(qū)的不同類(lèi)型微

5、生物源示蹤準(zhǔn)確率與平均源示蹤準(zhǔn)確率，用相同方法對(duì)所采集水樣中分離得到的E.coli樣本進(jìn)行微生物源示蹤，判斷不同宿主來(lái)源非點(diǎn)源污染的貢獻(xiàn)率。
　　 結(jié)果:
　　 采用無(wú)菌操作取得糞便樣本共380份，其中大連210份、濟(jì)南170份。另有濟(jì)南水樣15份，經(jīng)分離、鑒定共獲得E.coli菌株1171份其中大連616份、濟(jì)南555份。經(jīng)REP-PCR基因擴(kuò)增，共獲得產(chǎn)物1171份，DNA條帶多分布于100bp至5000bp之間，其

6、中以500bp～2000bp之間最多。同種宿主來(lái)源的樣本存在更多的共有特征條帶，不同地區(qū)同種宿主來(lái)源的樣本其特征條帶存在一定的差異，但仍可見(jiàn)共有的特征條帶。剔除重復(fù)的DNA指紋圖譜以避免偏倚，剔除后剩余DNA指紋圖譜889份，其中大連500份，濟(jì)南389份。通過(guò)ALPHAVIEW軟件將DNA指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化后，采用SPSS軟件進(jìn)行示蹤。
　　 對(duì)500株大連E.coli樣本進(jìn)行庫(kù)依賴(lài)與非庫(kù)依賴(lài)源示蹤，庫(kù)依賴(lài)方法RCC分別為雞源

7、94.9％、犬源95％、牛源99.1％、豬源94％、人源95.1％，ARCC為95.8％;非庫(kù)依賴(lài)法RCC分別為雞源67.9％、犬源74.0％、牛源65.5％、豬源66.7％、人源33.6％，ARCC為60.0％。
　　 對(duì)389株濟(jì)南E.coli樣本進(jìn)行庫(kù)依賴(lài)與非庫(kù)依賴(lài)源示蹤，庫(kù)依賴(lài)方法RCC分別為雞源98.5％、犬源97.1％、牛源100％、豬源96.9％、人源98.3％，ARCC為98.2％;非庫(kù)依賴(lài)法RCC分別為雞源78

8、.8％、犬源50.0％、牛源75.3％、豬源71.9％、人源62.1％，ARCC為66.8％。
　　 對(duì)大連與濟(jì)南共889株E.coli樣本進(jìn)行庫(kù)依賴(lài)與非庫(kù)依賴(lài)源示蹤，庫(kù)依賴(lài)方法RCC分別為大連-雞源92.4％、大連-犬源90.0％、大連-牛源88.5％、大連-豬源89.3％、大連-人源85.2％、濟(jì)南-雞源87.9％、濟(jì)南-犬源92.9％、濟(jì)南-牛源97.3％、濟(jì)南-豬源97.5％和濟(jì)南-人源90.5％，ARCC為89.9％。

9、非庫(kù)依賴(lài)法大連-雞源60.5％、大連-犬源48.0％、大連-牛源58.4％、大連-豬源12.3％、大連-人源23.8％、濟(jì)南-雞源74.7％、濟(jì)南-犬源41.4％、濟(jì)南-牛源56.2％、濟(jì)南-豬源65.6％和濟(jì)南-人源57.8％，ARCC為47.7％。
　　 對(duì)水樣中的E.coli分別進(jìn)行庫(kù)依賴(lài)法源示蹤和非庫(kù)依賴(lài)法源示蹤，結(jié)果均表明非點(diǎn)源糞便污染主要為未知來(lái)源，貢獻(xiàn)率約為30％（非庫(kù)依賴(lài)法）到70％（庫(kù)依賴(lài)法），其次為人源，再次

10、為雞源與犬源。
　　 結(jié)論:
　　 本課題結(jié)果表明基于REP-PCR法的微生物源示蹤技術(shù)具有較高的可靠性，在不同類(lèi)型的源解析方法下源示蹤準(zhǔn)確率絕大多數(shù)高于60％，特別是庫(kù)依賴(lài)的源解析方法下源示蹤準(zhǔn)確率表現(xiàn)優(yōu)秀，對(duì)于同一地區(qū)樣本可達(dá)94％以上，對(duì)于不同地區(qū)樣本在85％以上。庫(kù)依賴(lài)法受到地理性差異影響小于非庫(kù)依賴(lài)法，適宜更大范圍的應(yīng)用。同時(shí)結(jié)果還表明小清河沿岸的非點(diǎn)源污染類(lèi)型除未知來(lái)源外主要為人類(lèi)糞便，其次為雞源與犬源，這一