仿生關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ACECM)取向支架和ChondrO-Gide支架特性的比較.pdf

1、目的:比較仿生關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ACECM)取向支架和Chondro-Gide雙層支架的生物學(xué)特性;評價(jià)仿生關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)ACECM取向支架和Chondro-Gide(C-G)雙層支架復(fù)合自體關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)軟骨損傷的效果，以期為臨床應(yīng)用提供優(yōu)選和改進(jìn)的組織工程軟骨支架。
　　材料方法:取豬關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)濕法粉碎，差速離心，收集去細(xì)胞后的納米級軟骨細(xì)胞外基質(zhì)ECM，獲得關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞源性支架材料。運(yùn)用定向結(jié)晶

2、、冷凍干燥、物理、化學(xué)方法交聯(lián)技術(shù)，制成乳白色三維多孔海綿狀取向支架(ACECM支架)。Chondro-Gide支架購自瑞士，為豬皮膚膠原制作的雙層支架。將兩種支架采用下述方法進(jìn)行生物學(xué)特性比較。
　?。ㄒ唬﹥煞N支架物理特性的比較:用光鏡(LEM)和掃描電鏡(SEM)觀察兩種支架表面的物理特性，包括孔徑大小、孔道結(jié)構(gòu)、孔隙率;比較兩種支架的吸水膨脹率及生物力學(xué)特性。
　?。ǘ煞N支架復(fù)合兔軟骨細(xì)胞后做定性觀察:包括活細(xì)胞

3、在支架上的生長狀態(tài);甲苯胺藍(lán)(TO)、番紅花O、奧新藍(lán)（AB）組化染色，Ⅰ、Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色觀察其基質(zhì)。
　　（三）將兩種支架復(fù)合兔軟骨細(xì)胞后做定量分析:包括細(xì)胞在支架上生長情況（MTT法）;細(xì)胞粘附率檢測;羥脯氨酸總膠原蛋白定量;GAG定量;RT-PCR定量測定在支架上生長細(xì)胞的增殖數(shù)及表型。
　?。ㄋ模煞N支架植入大鼠皮下后分別于1、2、4周取材，鏡下觀察兩種支架植入體內(nèi)組織中可能的炎癥和免疫反應(yīng)。
　　

4、（五）取新西蘭大白兔30只，隨機(jī)分成5個(gè)組，手術(shù)建立關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型，用分離培養(yǎng)的第三代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞復(fù)合ACECM取向支架和Chondro-Gide雙層支架植入兔關(guān)節(jié)軟骨全層缺損，分別在手術(shù)后3月和6月后取材，通過對新生軟骨組織的大體觀察、組織學(xué)觀察和評分、GAG檢測，驗(yàn)證這兩種支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。
　　（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:ACECM取向支架:大體為圓形和圓柱形，乳白色海綿狀，掃描鏡下觀察具有縱取向

5、平行排列的孔道結(jié)構(gòu)，孔徑:150-260μm，孔隙率:91.75±3.73％;吸水膨脹率:35-45％,生物力學(xué)壓縮剛度:6.674±0.470 N/mm;彈性模量:3.303±0.233MPa。兔軟骨細(xì)胞復(fù)合支架后培養(yǎng)3天，活細(xì)胞熒光染色有大量活細(xì)胞生長。冰凍切片甲苯胺藍(lán)、番紅花O、奧新藍(lán)組化染色均為陽性。Ⅱ型膠原免疫組化染色為陽性、Ⅰ型膠原為陰性。定量分析:MTT毒性檢測為Ⅰ級。細(xì)胞復(fù)合支架后的粘附率:3hr為68％，6hr為86％

6、。支架加細(xì)胞后羥脯氨酸定量:10.42±2.73 ug/mg，GAG含量:25.12±4.12 ug/mg，DNA含量:10.52±5.79 ug/mg，RT PCR定量測定:RNA-0.2479, ColⅠ:0.412±0.1421, ColⅡ:4.312±0.5412, Aggrecan:3.761±0.4123,Sox-9:0.576±0.0812，Col X:0.132±0.0541。支架植入大鼠皮下后輕度炎癥反應(yīng)，無免疫反應(yīng)。

7、
　　Chondro-Gide支架:為乳白色，大體為方形，光鏡、掃描電鏡下觀察可見表層膠原呈致密橫向排列，孔徑:40-100μm。里層見疏松毛狀粗膠原，呈網(wǎng)狀，孔徑:50-180μm?？紫堵?67.75±2.73％，吸水膨脹率:10-15％。生物力學(xué)壓縮剛度:2.738±0.409 N/mm，彈性模量:1.355±0.202MPa。定性觀察:支架復(fù)合兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)3天后活細(xì)胞熒光染色表面有孔處活細(xì)胞生長良好。致密處細(xì)胞稀疏。從定量

8、分析可以得出:支架MTT毒性檢測為Ⅰ級。細(xì)胞粘附率:3hr為52％，6hr為74％。羥脯氨酸定量:2.09±1.05 ug/mg，GAG含量為:21.74±5.79 ug/mg，DNA含量為:7.31±4.37 ug/mg。RT PCR測定值:RNA-0.1547，ColⅠ:1.63±0.2145，ColⅡ:0.242±0.1163, Aggrecan:1.261±0.1321, Sox-9:3.075±0.4121, Col X:7.

9、561±1.2145。支架植入大鼠皮下后輕度炎癥反應(yīng)，無免疫反應(yīng)。
　　兩種支架分別復(fù)合兔軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的結(jié)果:空白組、單純支架組修復(fù)效果明顯不如軟骨細(xì)胞復(fù)合取向支架組和軟骨細(xì)胞復(fù)合Chondro-Gide組。利用SPSS10.0軟件，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析對5組3月、6月取材時(shí)間的大體評分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示:差異有顯著性意義，說明不同時(shí)間段標(biāo)本的修復(fù)效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較6月組軟骨細(xì)胞復(fù)合取向支架組和軟骨

10、細(xì)胞復(fù)合Chondro-Gide組差異P＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)評分結(jié)果顯示:利用SPSS10.0軟件，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析對五組支架組3月、6月各個(gè)取材時(shí)間的組織學(xué)評分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示:差異有顯著性意義，說明不同時(shí)間段標(biāo)本修復(fù)效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較以軟骨細(xì)胞復(fù)合取向支架組效果最好。GAG檢測結(jié)果經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞取向支架組、軟骨細(xì)胞Chondro-Gide組、正常關(guān)節(jié)軟骨組在各時(shí)間點(diǎn)

11、取材標(biāo)本的GAG含量均有差別，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。軟骨細(xì)胞取向支架組GAG含量高于軟骨細(xì)胞Chondro-Gide組(3月、6月)，但兩者均低于正常關(guān)節(jié)軟骨組。
　　結(jié)論:兩種支架各有特點(diǎn):ACECM支架組海綿多孔支架呈縱取向排列，表面橫向孔徑的大小、孔隙率、吸水膨脹率、細(xì)胞粘附率、GAG、Aggrecan、Ⅱ型膠原的含量均高于C-G支架組，作為軟骨組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨材料更具有優(yōu)越性。C-G支架組因上表層孔隙小，膠原排列緊密，下