仿生關節(jié)軟骨細胞外基質(ACECM)取向支架和ChondrO-Gide支架特性的比較.pdf

1、目的:比較仿生關節(jié)軟骨細胞外基質(ACECM)取向支架和Chondro-Gide雙層支架的生物學特性;評價仿生關節(jié)軟骨細胞外基質ACECM取向支架和Chondro-Gide(C-G)雙層支架復合自體關節(jié)軟骨細胞植入兔關節(jié)軟骨缺損修復軟骨損傷的效果，以期為臨床應用提供優(yōu)選和改進的組織工程軟骨支架。
　　材料方法:取豬關節(jié)軟骨，經(jīng)濕法粉碎，差速離心，收集去細胞后的納米級軟骨細胞外基質ECM，獲得關節(jié)軟骨去細胞源性支架材料。運用定向結晶

2、、冷凍干燥、物理、化學方法交聯(lián)技術，制成乳白色三維多孔海綿狀取向支架(ACECM支架)。Chondro-Gide支架購自瑞士，為豬皮膚膠原制作的雙層支架。將兩種支架采用下述方法進行生物學特性比較。
　?。ㄒ唬﹥煞N支架物理特性的比較:用光鏡(LEM)和掃描電鏡(SEM)觀察兩種支架表面的物理特性，包括孔徑大小、孔道結構、孔隙率;比較兩種支架的吸水膨脹率及生物力學特性。
　?。ǘ煞N支架復合兔軟骨細胞后做定性觀察:包括活細胞

3、在支架上的生長狀態(tài);甲苯胺藍(TO)、番紅花O、奧新藍（AB）組化染色，Ⅰ、Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色觀察其基質。
　　（三）將兩種支架復合兔軟骨細胞后做定量分析:包括細胞在支架上生長情況（MTT法）;細胞粘附率檢測;羥脯氨酸總膠原蛋白定量;GAG定量;RT-PCR定量測定在支架上生長細胞的增殖數(shù)及表型。
　?。ㄋ模煞N支架植入大鼠皮下后分別于1、2、4周取材，鏡下觀察兩種支架植入體內組織中可能的炎癥和免疫反應。
　　

4、（五）取新西蘭大白兔30只，隨機分成5個組，手術建立關節(jié)軟骨缺損動物模型，用分離培養(yǎng)的第三代兔關節(jié)軟骨細胞復合ACECM取向支架和Chondro-Gide雙層支架植入兔關節(jié)軟骨全層缺損，分別在手術后3月和6月后取材，通過對新生軟骨組織的大體觀察、組織學觀察和評分、GAG檢測，驗證這兩種支架修復關節(jié)軟骨缺損的可行性。
　　（六）統(tǒng)計學分析。
　　結果:ACECM取向支架:大體為圓形和圓柱形，乳白色海綿狀，掃描鏡下觀察具有縱取向

5、平行排列的孔道結構，孔徑:150-260μm，孔隙率:91.75±3.73％;吸水膨脹率:35-45％,生物力學壓縮剛度:6.674±0.470 N/mm;彈性模量:3.303±0.233MPa。兔軟骨細胞復合支架后培養(yǎng)3天，活細胞熒光染色有大量活細胞生長。冰凍切片甲苯胺藍、番紅花O、奧新藍組化染色均為陽性。Ⅱ型膠原免疫組化染色為陽性、Ⅰ型膠原為陰性。定量分析:MTT毒性檢測為Ⅰ級。細胞復合支架后的粘附率:3hr為68％，6hr為86％

6、。支架加細胞后羥脯氨酸定量:10.42±2.73 ug/mg，GAG含量:25.12±4.12 ug/mg，DNA含量:10.52±5.79 ug/mg，RT PCR定量測定:RNA-0.2479, ColⅠ:0.412±0.1421, ColⅡ:4.312±0.5412, Aggrecan:3.761±0.4123,Sox-9:0.576±0.0812，Col X:0.132±0.0541。支架植入大鼠皮下后輕度炎癥反應，無免疫反應。

7、
　　Chondro-Gide支架:為乳白色，大體為方形，光鏡、掃描電鏡下觀察可見表層膠原呈致密橫向排列，孔徑:40-100μm。里層見疏松毛狀粗膠原，呈網(wǎng)狀，孔徑:50-180μm?？紫堵?67.75±2.73％，吸水膨脹率:10-15％。生物力學壓縮剛度:2.738±0.409 N/mm，彈性模量:1.355±0.202MPa。定性觀察:支架復合兔軟骨細胞培養(yǎng)3天后活細胞熒光染色表面有孔處活細胞生長良好。致密處細胞稀疏。從定量

8、分析可以得出:支架MTT毒性檢測為Ⅰ級。細胞粘附率:3hr為52％，6hr為74％。羥脯氨酸定量:2.09±1.05 ug/mg，GAG含量為:21.74±5.79 ug/mg，DNA含量為:7.31±4.37 ug/mg。RT PCR測定值:RNA-0.1547，ColⅠ:1.63±0.2145，ColⅡ:0.242±0.1163, Aggrecan:1.261±0.1321, Sox-9:3.075±0.4121, Col X:7.

9、561±1.2145。支架植入大鼠皮下后輕度炎癥反應，無免疫反應。
　　兩種支架分別復合兔軟骨細胞修復關節(jié)軟骨缺損的結果:空白組、單純支架組修復效果明顯不如軟骨細胞復合取向支架組和軟骨細胞復合Chondro-Gide組。利用SPSS10.0軟件，完全隨機設計的方差分析對5組3月、6月取材時間的大體評分結果進行統(tǒng)計學分析，結果顯示:差異有顯著性意義，說明不同時間段標本的修復效果有統(tǒng)計學意義。兩兩比較6月組軟骨細胞復合取向支架組和軟骨

10、細胞復合Chondro-Gide組差異P＞0.05，沒有統(tǒng)計學意義。組織學評分結果顯示:利用SPSS10.0軟件，完全隨機設計的方差分析對五組支架組3月、6月各個取材時間的組織學評分結果進行統(tǒng)計學分析，結果顯示:差異有顯著性意義，說明不同時間段標本修復效果有統(tǒng)計學意義，兩兩比較以軟骨細胞復合取向支架組效果最好。GAG檢測結果經(jīng)完全隨機設計的方差分析結果顯示，軟骨細胞取向支架組、軟骨細胞Chondro-Gide組、正常關節(jié)軟骨組在各時間點

11、取材標本的GAG含量均有差別，差異具有統(tǒng)計學意義。軟骨細胞取向支架組GAG含量高于軟骨細胞Chondro-Gide組(3月、6月)，但兩者均低于正常關節(jié)軟骨組。
　　結論:兩種支架各有特點:ACECM支架組海綿多孔支架呈縱取向排列，表面橫向孔徑的大小、孔隙率、吸水膨脹率、細胞粘附率、GAG、Aggrecan、Ⅱ型膠原的含量均高于C-G支架組，作為軟骨組織工程修復關節(jié)軟骨材料更具有優(yōu)越性。C-G支架組因上表層孔隙小，膠原排列緊密，下