以天然骨基質(zhì)明膠-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合山羊椎間盤細(xì)胞構(gòu)建一體化組織工程椎間盤的實驗研究.pdf

1、目的：探討以骨基質(zhì)明膠/軟骨細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合山羊椎間盤細(xì)胞構(gòu)建一體化組織工程椎間盤的可行性。
　　 方法：⑴取豬股骨，將豬股骨近端松質(zhì)骨經(jīng)脫鈣、脫細(xì)胞處理后，制備外徑為10mm、內(nèi)徑5mm、高3mm的骨基質(zhì)明膠環(huán);刮取豬股骨近端軟骨，經(jīng)研磨、脫細(xì)胞處理制成勻漿;Hoechst33258染色檢測兩種支架材料脫細(xì)胞情況，再將軟骨勻漿注入骨基質(zhì)明膠環(huán)中央，經(jīng)冷凍干燥、交聯(lián)后制備成一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架;掃描電鏡、HE、天狼星紅染色觀

2、察支架結(jié)構(gòu);檢測支架的孔隙率、吸水率以及敷水狀態(tài)的壓縮力學(xué)性能（力學(xué)性能與正常豬尾椎間盤對比）。⑵消化分離山羊纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，同時對第1代細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)、番紅O染色以及Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色;將第1代纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞分別以密度1×107個/ml接種至支架的纖維環(huán)相及髓核相上，體外培養(yǎng)2d，倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學(xué)染色觀察細(xì)胞在支架上的粘附情況，LIVE/DEAD染色觀察細(xì)胞在支架上的活性;

3、細(xì)胞支架復(fù)合物分別培養(yǎng)2w和4w，Real-time PCR技術(shù)檢測支架中椎間盤細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ型膠原、聚集蛋白多糖的基因表達(dá)水平（正常椎間盤組織中的椎間盤細(xì)胞作為對照）。⑶獲取足夠數(shù)量的第1代纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞，將兩種細(xì)胞均進(jìn)行PKH26染液標(biāo)記，檢測PKH26染液標(biāo)記前后的髓核細(xì)胞生物學(xué)特性;將椎間盤細(xì)胞以密度1×107個/ml接種至支架的相應(yīng)部位，細(xì)胞支架復(fù)合物體外培養(yǎng)2d后，將其植入裸鼠背部皮下;體內(nèi)培養(yǎng)6w后，肉眼觀察裸鼠背部植

4、入部位情況，小動物活體熒光成像系統(tǒng)檢測體內(nèi)熒光分布情況;處死裸鼠，取出細(xì)胞支架復(fù)合物，行冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察，同時行Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色以及番紅O染色。
　　 結(jié)果：①Hoechst33258染色示支架材料脫細(xì)胞后未見細(xì)胞殘留;支架敷水后，大體觀察外層纖維環(huán)相呈乳白色，髓核相為透明狀，兩相分界明顯;掃描電鏡下支架孔隙分布均勻，孔隙相互連通，纖維環(huán)相孔徑為（372.3±139.8）μm，髓核相孔徑為（112.4±21.

5、8）μm; HE染色顯示支架交界區(qū)界限清晰，連接緊密，支架淡染;天狼星紅染色示纖維環(huán)相深紅色，髓核相呈紅黃綠相間色;支架孔隙率為73.37％±2.56％，吸水率為655.7％±78.6％;敷水狀態(tài)下，支架的壓縮彈性模量為49.06±15.57 kPa，正常豬尾椎間盤壓縮彈性模量為135.9±28.9kPa，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。②鏡下纖維環(huán)細(xì)胞呈長梭形，髓核細(xì)胞呈短梭形或卵圓形，兩種細(xì)胞在第5代開始出現(xiàn)衰老的形態(tài)表現(xiàn);

6、第1代纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞甲苯胺藍(lán)、番紅O染色均為陽性，纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性、Ⅱ型膠原免疫組化染色弱陽性，髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性、Ⅰ型膠原免疫組化染色弱陽性;細(xì)胞接種支架后，倒置相差顯微鏡下、掃描電鏡、HE染色觀察兩種細(xì)胞在支架上粘附良好，LIVE/DEAD染色示兩種細(xì)胞在支架上呈綠色熒光;Real-timePCR檢測示支架上椎間盤細(xì)胞的聚集蛋白多糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原基因表達(dá)水平均比正常椎間盤細(xì)胞顯著增高。③P

7、KH26染液標(biāo)記后的纖維環(huán)細(xì)胞及髓核細(xì)胞在熒光顯微鏡下均呈紅色熒光，且熒光分布均勻，標(biāo)記前后髓核細(xì)胞的增殖及聚集蛋白多糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原基因表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);細(xì)胞支架復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)6w后，肉眼觀察在裸鼠皮下植入部位周圍無感染及炎癥反應(yīng)，細(xì)胞支架復(fù)合物呈圓盤狀，與皮膚內(nèi)面愈合，小動物活體熒光成像系統(tǒng)顯示在髓核相及纖維環(huán)相上均可見有熒光分布;熒光顯微鏡下，纖維環(huán)相及髓核相上均可見點狀紅色熒光;Ⅰ型膠原免疫組化染色纖維環(huán)相及