人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?評(píng)價(jià)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。主要包括四部分內(nèi)容:(一)鑒定hUCMSCs的生物學(xué)特性,體外構(gòu)建hUCMSCs/軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架復(fù)合體,并植入裸大鼠背部皮下異位構(gòu)建組織工程軟骨;(二)hUCMSCs復(fù)合在纖維蛋白凝膠(fibringel,FG)中修復(fù)裸大鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損的初步研究;(三)hUCMSCs/軟骨

2、細(xì)胞外基質(zhì)支架復(fù)合體異種移植修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究;(四)制備可雙相釋放兩種生長(zhǎng)因子的軟骨組織工程取向支架。
　　實(shí)驗(yàn)方法:(1)選取第4代hUCMSCs進(jìn)行體外成軟骨、成骨、成脂肪誘導(dǎo),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志,與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架復(fù)合體外構(gòu)建組織工程軟骨,體外成軟骨誘導(dǎo)2周后植入裸大鼠背部皮下異位成軟骨,4周后取材進(jìn)行大體觀察及組織學(xué)分析。(2)hUCMSCs復(fù)合在纖維蛋白凝膠中,體外成軟骨誘導(dǎo)2周后,行Dead/L

3、ive染色檢測(cè)細(xì)胞活性,植入裸大鼠股骨滑車遠(yuǎn)端直徑2.0mm,深1.0mm的軟骨缺損,4周后取材行大體觀察及組織學(xué)分析。(3)在新西蘭大白兔股骨滑車遠(yuǎn)端做直徑4.0mm,深1.0mm的全層關(guān)節(jié)軟骨缺損,分別植入單純支架、未誘導(dǎo)hUCMSCs/軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架復(fù)合體、誘導(dǎo)的hUCMSCs/軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架復(fù)合體以及缺損曠置組。分別在植入術(shù)后3、6、12、16個(gè)月取材,對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)分析及生物化學(xué)檢測(cè),并按照ICRS(I

4、nternationalCartilageRepairSociety)大體評(píng)分及MODS(ModifiedO’DriscollScore)組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。(4)利用W/O/W的雙乳化溶劑揮發(fā)技術(shù)制備負(fù)載胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)的PLGA微球,與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)材料混勻,通過(guò)熱誘導(dǎo)的相分離技術(shù)(thermal-inducedphaseseparation,TIPS)制備成組織工程軟骨取向支架。利用等離子體處理技術(shù)

5、(plasmatreatment)將TGF-β1錨定在支架表面上。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)hUCMSCs為成纖維樣細(xì)胞形態(tài),貼壁生長(zhǎng);體外成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色陽(yáng)性,成軟骨誘導(dǎo)后番紅花O染色及Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性,成脂肪誘導(dǎo)后油紅O染色陽(yáng)性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明hUCMSCs陽(yáng)性表達(dá)CD105、CD90、CD73、CD44、HLA-ABC,陰性表達(dá)CD34、CD45、HLA-DPDQDR;hUCMSCs復(fù)合軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架,無(wú)論誘導(dǎo)組還是

6、未誘導(dǎo)組都能在裸大鼠背部皮下形成類軟骨組織,未誘導(dǎo)組甲苯胺藍(lán)染色及番紅O染色呈弱陽(yáng)性,而誘導(dǎo)組呈強(qiáng)陽(yáng)性。(2)hUCMSCs復(fù)合在纖維蛋白凝膠中,無(wú)論誘導(dǎo)組還是未誘導(dǎo)組都能在裸大鼠關(guān)節(jié)軟骨缺損處生成軟骨組織。(3)hUCMSCs復(fù)合軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損,在植入術(shù)后3、6、12、16月4個(gè)時(shí)間點(diǎn),未誘導(dǎo)組的修復(fù)組織ICRS評(píng)分及MODS評(píng)分都顯著高于誘導(dǎo)組;在未誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)組,術(shù)后6個(gè)月ICRS評(píng)分及MODS評(píng)分達(dá)到最高

7、,12個(gè)月及16個(gè)月評(píng)分逐漸降低;術(shù)后6個(gè)月時(shí)未誘導(dǎo)組GAG含量顯著高于誘導(dǎo)組。(4)制備的負(fù)載胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)的PLGA微球,激光共聚焦顯微鏡顯示微球內(nèi)部呈中空多囊腔結(jié)構(gòu);免疫熒光檢查顯示兩種生長(zhǎng)因子都成功負(fù)載在支架上;體外緩釋研究顯示2種生長(zhǎng)因子都能緩釋30天以上。
　　結(jié)論:(1)hUCMSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞,具備異位成軟骨能力,體外誘導(dǎo)有利于體內(nèi)軟骨基質(zhì)形成。(2)hUCMSCs復(fù)合在纖維蛋白凝膠中能在在裸

8、大鼠軟骨缺損區(qū)生成軟骨組織。(3)hUCMSCs復(fù)合軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架能夠修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損;未誘導(dǎo)的hUCMSCs修復(fù)效果優(yōu)于體外成軟骨誘導(dǎo)的hUCMSCs;體內(nèi)產(chǎn)生的修復(fù)組織16個(gè)月后出現(xiàn)不同程度的退變。(4)用W/O/W的雙乳化溶劑揮發(fā)技術(shù)(doubleemulsionsolventevaporation)成功制備出包載胰島素樣生長(zhǎng)因子的微球;利用微球包載及等離子體處理錨定技術(shù)成功制備出能雙相釋放兩種生長(zhǎng)因子的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支