嗅鞘細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討大鼠嗅粘膜來(lái)源的嗅鞘細(xì)胞(OECs)的生物學(xué)特性，分析以O(shè)ECs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程支架，應(yīng)用于移植治療脊髓損傷的潛在優(yōu)勢(shì)；構(gòu)建含OECs的細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架，并對(duì)該細(xì)胞/支架的形態(tài)學(xué)特征和生物相容性進(jìn)行觀察和評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用OECs/組織工程支架移植治療脊髓損傷的可行性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)研究資料。 方法： 1.自成年大鼠鼻中隔活體剪取部分嗅粘膜制成細(xì)胞懸液，用含10％胎牛血清的DMEM/F12混合培養(yǎng)基培養(yǎng)

2、，動(dòng)態(tài)觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，在免疫細(xì)胞化學(xué)染色的輔助下，分析嗅粘膜原代培養(yǎng)物的細(xì)胞類(lèi)型及其社會(huì)學(xué)特性，并探討嗅粘膜混合細(xì)胞移植治療脊髓損傷的可行性。 2.應(yīng)用差速貼壁和連續(xù)傳代培養(yǎng)技術(shù)，自嗅粘膜混合細(xì)胞中自然純化OECs。在免疫細(xì)胞化學(xué)染色、免疫印跡和免疫電鏡的輔助下，研究純化后OECs的生物學(xué)特性。 3.在新鮮鼠血漿中凝血酶的促凝作用下，30 min內(nèi)纖維蛋白原、纖粘連蛋白和層粘連蛋白制成單層毯狀和實(shí)心圓柱狀支架

3、。支架進(jìn)行外形測(cè)量、表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的電鏡觀察、穩(wěn)定性試驗(yàn)、吸水性試驗(yàn)以及體內(nèi)相容性評(píng)價(jià)。 4.在毯狀支架表面和圓柱狀支架內(nèi)部種植純化的OECs。應(yīng)用免疫熒光染色、免疫印跡、掃描和透射電鏡等技術(shù)，分析支架對(duì)OECs粘附、增殖、突起延伸和蛋白表達(dá)的影響。 5.在研究單層毯狀支架的基礎(chǔ)上，由四層毯狀支架和三層OECs構(gòu)建一含細(xì)胞的夾層細(xì)胞外基質(zhì)支架，研究夾層支架內(nèi)OECs的增殖和分化情況。 結(jié)果： 1.成年大鼠

4、嗅粘膜原代培養(yǎng)細(xì)胞中包含嗅神經(jīng)成纖維細(xì)胞(ONFs)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)、嗅覺(jué)神經(jīng)元(ORNs)和嗅鞘細(xì)胞(OECs)等多種細(xì)胞類(lèi)型，不同類(lèi)型細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特性存在差異性。NSCs呈球形，不直接貼附于培養(yǎng)基底面，而粘著在首先貼壁的Vimentin+/Laminin+ONFs表面進(jìn)行分裂和分化，部分NSCs繼續(xù)增殖形成Nestin+克隆球，14天后克隆球停止生長(zhǎng)，球周的干細(xì)胞逐漸向外遷移并分化為NSE+的ORNs和GFAP+/NGF

5、Rp75+/S100V+的OECs。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，嗅鞘細(xì)胞增殖旺盛，在嗅粘膜細(xì)胞中比例不斷增大。 2.純化后的OECs除表達(dá)三種特異性標(biāo)記蛋白(GFAP/NGFRp75/S100B)外，還可表達(dá)NGF、BDNF、NT-3和相應(yīng)酪氨酸蛋白激酶受體P-FrkA、TrkB、TrkC，Laminin及其整合素受體laminin R和Integrin B2，VEGF，以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、MMP-9等。 3.40uL

6、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和新鮮血漿的混合物可制備一直徑12.0 mm、厚度0.35mm、透明的毯狀支架，或一直徑2.8 mm、長(zhǎng)度7.0 mm的圓柱狀支架。掃描和透射電鏡結(jié)果顯示，支架表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)均為纖維交織而成的三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大約1.5um。支架置于緩沖水溶液中28天后結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定。支架含水量豐富，平衡水容量可達(dá)93.16+1.06％。支架的體內(nèi)相容性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：支架內(nèi)部有大量組織細(xì)胞和新生血管的浸潤(rùn)，與周?chē)M織無(wú)明顯分界線，最終可被

7、正常組織所替代。 4.支架組，種植1、3、5h時(shí)的OECs粘附率均高于對(duì)照組(圓蓋玻片)(P<0.01)。支架表面的細(xì)胞在培養(yǎng)早期增殖迅速，較對(duì)照組提前7天達(dá)到增殖高峰。支架組細(xì)胞突起明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，培養(yǎng)后期突起線性排列明顯，且具有一定方向性。掃描電鏡顯示體外培養(yǎng)3天時(shí)，支架表面的OECs排列松散，突起較短，14天后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列緊密，其長(zhǎng)突起可沿同一方向延伸并成束，最終覆蓋整個(gè)支架表面。此外，支架表面的O

8、ECs可持續(xù)表達(dá)NGF、BDNF、NT-3等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素和MMP-3、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶，并高于對(duì)照組。免疫熒光染色和透射電鏡結(jié)果顯示OECs在圓柱狀支架內(nèi)能正常生長(zhǎng)、有序遷移和延伸突起，細(xì)胞胞體和突起周?chē)沙霈F(xiàn)支架降解殘留的組織間隙。 5.由頂層至底層，細(xì)胞外基質(zhì)夾層支架內(nèi)的OECs數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞突起逐漸延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒數(shù)量逐漸增多及電子密度逐漸增高；細(xì)胞在水平方向可平行排列，亦可在相鄰支架之間縱向遷移；OECs

9、的細(xì)胞膜可與支架緊密粘附，支架內(nèi)局部出現(xiàn)組織間隙。 結(jié)論： 1.成年大鼠嗅粘膜原代培養(yǎng)細(xì)胞中至少存在四種細(xì)胞類(lèi)型，細(xì)胞間具有協(xié)調(diào)的細(xì)胞社會(huì)學(xué)關(guān)系，對(duì)嗅粘膜混合細(xì)胞移植治療脊髓損傷的可行性值得進(jìn)一步深入研究；純化后傳代培養(yǎng)的OECs細(xì)胞活力較強(qiáng)，并在促進(jìn)神經(jīng)再生、改建細(xì)胞外基質(zhì)等方面具有廣泛的生物學(xué)潛能，可作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程支架以用于移植治療脊髓損傷。 2.細(xì)胞外基質(zhì)支架具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，體外水溶液中結(jié)構(gòu)

10、持續(xù)穩(wěn)定，含水量豐富，體內(nèi)則具有可降解性和良好的組織相容性。支架對(duì)OECs的粘附、增殖和突起延伸具有顯著的促進(jìn)作用。OECs種植于支架后，在體外培養(yǎng)過(guò)程中仍然保持原有的生物學(xué)特性，如表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素和MMPs等，而MMPs可能是細(xì)胞在支架內(nèi)遷移和延伸突起的重要因素。 3.0ECs在細(xì)胞外基質(zhì)柱狀支架和夾層支架內(nèi)能正常增殖和分化，細(xì)胞與支架間具有良好的組織相容性。該柱狀支架和夾層支架可作為OECs三維生長(zhǎng)的載體，用于移植治療神經(jīng)系統(tǒng)