腺病毒介導的PUMA過表達對小鼠肝再生的影響.pdf

1、促凋亡蛋白PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)作為重要的p53靶分子，屬于凋亡相關蛋白Bcl-2家族，是BH3-only亞族的重要成員，僅擁有一個BH3結構域，通過和其他家族成員的相互作用，發(fā)揮轉導凋亡信號的功能，在凋亡信號通路中處于中心位置。此外，它在進化上極端保守，例如小鼠和人PUMA的基因同源性為91％，蛋白質同源性為90％；puma基因通過可變剪接能夠產生多個轉錄本，其中有活

2、性的產物主要是PUMA-α(23kDa)和PUMA-β(18kDa)。 在生理狀態(tài)下PUMA受到嚴格地調控，基礎表達量較低；但在多種應激因素(如DNA損傷，缺氧，糖皮質激素及血清撤除等)刺激下，可通過p53依賴和非依賴兩條途徑被誘導，產生顯著的促凋亡效應。 由于肝再生過程中涉及到多個Bcl-2家族成員(如Bcl-2，Bcl-XL，Bax等)參與，但它們在肝再生早期的表達關系難以解釋此時細胞凋亡罕見的現象；此外BH3-on

3、ly亞族分子對肝再生的調控作用未知，因此我們選擇了和已知的肝再生凋亡通路關系密切的PUMA作為研究的切入點，運用腺病毒介導的基因過表達技術，探討它對肝再生早期的影響及其作用機制。 本課題研究的主要內容是：1、肝再生早期PUMA及其相關基因的表達變化：2、腺病毒介導基因過表達模型的建立；3、過表達PUMA對肝再生的影響。 首先，我們通過Western blotting、Real time PCR和免疫組織化學研究發(fā)現，PU

4、MA在肝內圍繞小葉中央靜脈呈極性分布，其基礎表達量較低；在肝再生早期(0h～72h)PUMA在mRNA和蛋白水平均發(fā)生顯著下調，這種依賴轉錄的表達下調和轉錄抑制因子Slug的上調存在一定的相關性，而和p53在肝再生早期的上調無關；與其密切相關的Bcl-2家族成員Bcl-XL和Bax在蛋白水平均逐漸上調，并且Bax的變化與p53相關，然而凋亡效應酶Caspase3卻未見激活。 為了解這些現象之間的內在聯系，我們于是采用腺病毒介導的

5、基因轉移技術，通過尾靜脈注射的方法使重組腺病毒Ad-PUMA和腺病毒空載體Ad-GFP感染C57小鼠肝臟，令外源基因在肝臟過表達，爾后進行部分肝臟切除術，檢測術后24h再生肝細胞的增殖和凋亡情況。結果發(fā)現用高劑量(4×108ifu)Ad-GFP感染小鼠，可以獲得約30％的肝臟感染效率，并能在注射后3～8天維持外源基因的表達，對術后1～5天的再生肝重量無明顯影響；而用極高劑量(1×109ifu)和高劑量(4×108ifu)Ad-PUMA注

6、射小鼠會誘導急性肝衰竭，注射后48h死亡率分別為100％和35.7％，組織學檢測顯示肝細胞出現明顯水腫、壞死，肝門部位嚴重出血和炎細胞侵潤。低劑量(2×108ifu)Ad-PUMA預處理后，術前未見小鼠急性期死亡，肝臟也無異常表現，但術后24h死亡率驟升至66.7％，解剖見殘余肝臟腫脹明顯，組織學檢測Ad-PUMA的肝臟感染效率僅約10％；Western blotting檢測術后24h PUMA較正常水平僅上調約1倍；PCNA和TUNE

7、L染色表明再生肝細胞增殖減少，凋亡增多，并伴有明顯的炎癥改變；Ad-PUMA感染后能使Bcl-XL反應延遲并上調Bax水平。與此對照，Ad-GFP在相同劑量下并不會引起小鼠急性期死亡和明顯的炎癥反應，也不顯著升高術后24h死亡率，同溶劑組(注射等體積PBS)比較亦無明顯差異。 因此我們認為腺病毒介導的基因轉移技術可以高效地使外源基因在肝臟表達，并且腺病毒載體本身在當前的劑量下不會產生顯著的肝臟毒性，經Ad-GFP注射后小鼠的手術

8、耐受性好，腺病毒載體并不影響再生肝的重量，不會干擾肝再生的總體進程。 而PUMA的輕度過表達即可影響早期肝再生進程，引起明顯的肝臟病理改變，說明它的下調對肝再生具有非常積極的意義，這可能是術后殘余肝細胞在再生早期抵御凋亡的機制之一。其生理意義在于：通過調節(jié)PUMA的表達水平來發(fā)揮肝細胞的自我保護作用，降低肝細胞對外界不良刺激的敏感性，提高對凋亡的反應閾值，有利于肝細胞進入增殖周期。其作用機制可能包括在Slug調節(jié)下轉錄受抑，從而