腺病毒介導syndecan-1過表達對心肌梗死大鼠心室重構(gòu)的影響及機制探討.pdf

1、心肌梗死(myocardailinfarction，MI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)患者嚴重的心臟事件，其后的心室重構(gòu)可導致心力衰竭、心跳驟停、惡性室性心律失常甚至心源性猝死，嚴重威脅人類健康。如何有效防治MI后心室重構(gòu)一直是心血管基礎與臨床研究的重點和熱點。近年來，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和β受體阻滯劑等多種藥物應用于臨床，取得了一定的療效，但仍無法阻止心室重構(gòu)的發(fā)生。這說明影響MI后心室重構(gòu)的因素

2、還有很多。國外學者初步研究發(fā)現(xiàn)，粘結(jié)蛋白聚糖-1(Syndedan-1，Sdc1)在心肌損傷修復過程中作為炎癥和基質(zhì)重構(gòu)的中心調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)，在病理性心室重構(gòu)中起負性調(diào)節(jié)作用，但具體機制尚不明確。作為防治心室重構(gòu)的新靶點，明確Sdc1在MI后體內(nèi)表達的特點，并探討其作用和機制具有十分重要的意義。 本研究：①以MI大鼠為模型，分時段定量觀察Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達的時間分布特點；②構(gòu)建攜帶大鼠Sdc1cDNA的重組腺病毒載體Ad—

3、CMV—GFP—Sdc1；③在體轉(zhuǎn)染Ad—CMV—GFP—Sdc1，使Sdc1在MI大鼠體內(nèi)過表達，觀察其對膠原合成、心室重構(gòu)和心臟功能的影響，并初步探討其可能的作用機制，旨在為MI后心室重構(gòu)的防治提供新的思路和實驗依據(jù)。 第一章Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達的時間分布特點 1.1目的:建立MI大鼠模型，定量觀察Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達的時間分布特點。 1.2方法: 1.2.1分組：SD大鼠44只，結(jié)扎前降

4、支建立MI大鼠模型。術后24h存活大鼠隨機分為MI1天組(MI1d組)、MI3天組(MI3d組)、MI7天組(MI7d組)和MI14天組(MI14d組)。另設假手術組。每組n=6。 1.2.2方法：觀察結(jié)束時處死大鼠，檢測以下指標： 1.2.2.1MI大鼠模型的建立與評估指標：①MI面積(HE染色)；②梗死邊緣區(qū)膠原沉積情況(Masson染色)；③心臟功能(超聲心動圖和血流動力學檢查)；④心臟重量。 1.2.2.

5、2Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達的時間分布特點指標：檢測不同時間段梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA(RealtimePCR)、蛋白(Westernblot)和血清中可溶性Sdc1(ELISA法)表達水平。 1.3結(jié)果: 1.3.1MI大鼠模型的建立與評估：各組大鼠MI面積無差異(P>0.05)。假手術組大鼠心肌膠原纖維少，心臟各室壁厚度正常，運動協(xié)調(diào)。MI14d組大鼠梗死邊緣區(qū)膠原纖維增加，左室前壁變薄，室壁運動減弱或消失，心臟功

6、能下降(P<0.01)，心室重量增加(P<0.01)。 1.3.2Sdc1在MI大鼠體內(nèi)表達的時間分布特點：假手術組大鼠心肌Sdc1mRNA和蛋白表達量低，血清中可溶性Sdc1水平低。MI術后大鼠梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA和蛋白表達逐漸增加，血清中可溶性Sdc1水平逐漸升高，三者均在第3天達到高峰，此后逐漸下降，各組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 1.3.3Pearson相關分析顯示：MI大鼠血清中可溶性Sdc1

7、水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織Sdc1蛋白表達水平呈正相關(r=0.952，n=30，t=16.533，P<0.01)。 1.4小結(jié): 1.4.1采用結(jié)扎前降支法成功建立MI大鼠模型，模型的可重復性和均一性良好。 1.4.2基礎狀態(tài)下，大鼠心肌可檢測到Sdc1mRNA和蛋白表達，血清中存在可溶性Sdc1，三者表達水平均較低。MI大鼠梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA和蛋白表達明顯增加，血清中可溶性Sdc1水平顯著升高，三者均在

8、第3天達到高峰，此后逐漸下降，呈現(xiàn)動態(tài)變化。 1.4.3MI大鼠血清中可溶性Sdc1水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織Sdc1蛋白表達水平呈正相關。 第二章重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1的構(gòu)建 2.1目的:構(gòu)建攜帶大鼠Sdc1cDNA的重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1。 2.2方法: 采用基因重組技術和改良的體外連接法構(gòu)建重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1；在293細胞中

9、擴增，CsCl梯度離心純化，以基因測序、酶切及PCR法進行鑒定，用TCID50法測定病毒的生物活性。 2.3結(jié)果: 基因測序顯示質(zhì)粒pCMV—Sport6.1-Sdc1正確攜帶大鼠Sdc1基因。酶切結(jié)果顯示成功構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒質(zhì)粒。PCR證實重組腺病毒攜帶Sdc1基因片段，提示Ad—CMV—GFP—Sdc1構(gòu)建成功。TCID50法測得重組腺病毒生物活性為2×1011PFU/mL。 2.4小結(jié):

10、 采用基因重組技術和改良的體外連接法成功構(gòu)建出攜帶大鼠Sdc1基因的重組腺病毒載體Ad—CMV—GFP—Sdc1，經(jīng)擴增和純化，獲得重組腺病毒生物活性為2×1011PFU/mL。 第三章Sdc1過表達對MI大鼠心室重構(gòu)的影響及機制探討 3.1目的:在體轉(zhuǎn)染Ad—CMV—GFP—Sdc1，觀察Sdc1過表達對MI大鼠心室重構(gòu)和心臟功能的影響并探討其可能的作用機制。 3.2方法: 3.2.1分組：SD大鼠4

11、8只，結(jié)扎前降支術后即刻，在梗死邊緣區(qū)行心肌內(nèi)注射。根據(jù)注射內(nèi)容物的不同分組：①MIAd—CMV—GFP—Sdc1轉(zhuǎn)染組(n=8，注射Ad—CMV—GFP—Sdc1)；②MIAd—GFP對照組(n=8，注射Ad—GFP)；③MI鹽水組(n=8，注射生理鹽水)；④假手術組(n=6)。 3.2.2方法：重組腺病毒轉(zhuǎn)染術后14天處死大鼠，檢測以下指標： 3.2.2.1重組腺病毒轉(zhuǎn)染與鑒定的指標：①注射點腺病毒的表達(觀察綠色熒

12、光)；②梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA(RealtimePCR)、蛋白(Westernblot)和血清中可溶性Sdc1(ELISA法)表達水平。 3.2.2.2Sdc1過表達對MI大鼠心室重構(gòu)影響的指標：①Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達比例(天狼星紅染色)和排列情況(透射電鏡)；②Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA水平(RealtimePCR法)；③MI面積、CVF、羥脯氨酸含量、膠原含量和心臟重量。 3.2.2.3Sdc1過表達對MI大鼠心臟功能

13、影響的指標：超聲心動圖和血流動力學檢查。 3.2.2.4Sdc1作用機制探討的指標：①對炎癥的影響(HE染色)；②對心肌細胞凋亡的影響(TUNEL法)；③p38MAPKmRNA(RealtimePCR)和蛋白(Westernblot法)表達水平。 3.4小結(jié): 3.4.1采用心肌內(nèi)注射法成功在體轉(zhuǎn)染重組腺病毒，使Sdc1在轉(zhuǎn)染后的MI大鼠體內(nèi)過表達。 3.4.2MI大鼠心室重量和膠原含量增加，心功能下降，

14、存在心室重構(gòu)。Sdc1過表達能減輕心室重量，減少膠原合成，改善心室重構(gòu)和心臟功能，提示Sdc1可能在MI后心室重構(gòu)中具有重要作用。 3.4.3MI大鼠梗死邊緣區(qū)有大量炎癥細胞浸潤，心肌細胞大量凋亡；Sdc1過表達能減少炎癥細胞和凋亡細胞，提示Sdc1可能通過影響炎癥反應和心肌細胞凋亡參與MI后心室重構(gòu)。 3.4.4MI大鼠梗死邊緣區(qū)p38MAPK信號傳導通路明顯活化，Sdc1過表達能抑制p38MAPK信號傳導通路活性，提

15、示Sdc1可能通過p38MAPK信號傳導通路起作用，但具體機制有待進一步研究。 全文結(jié)論 4.1MI大鼠梗死邊緣區(qū)Sdc1mRNA和蛋白表達增加，血清中可溶性Sdc1水平升高，三者均在第3天達到高峰，此后逐漸下降，呈現(xiàn)動態(tài)變化。MI大鼠血清中可溶性Sdc1水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織Sdc1蛋白表達水平呈正相關。 4.2采用基因重組技術和改良的體外連接法，成功構(gòu)建出攜帶大鼠Sdc1基因的重組腺病毒載體。 4.

16、3采用心肌內(nèi)注射法成功在體轉(zhuǎn)染重組腺病毒，使Sdc1在轉(zhuǎn)染后的MI大鼠體內(nèi)過表達。 4.4Sdc1過表達能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)膠原合成，改善心室重構(gòu)和心臟功能，提示Sdc1可能在MI后心室重構(gòu)中具有重要作用。 4.5Sdc1過表達能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)炎癥反應和細胞凋亡，提示Sdc1可能通過影響炎癥反應和細胞凋亡參與MI后心室重構(gòu)。 4.6Sdc1過表達能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)p38MAPK信號傳導通路的活性