腺病毒介導的CNTF基因在大鼠脊髓表達的實驗研究.pdf

1、目的:睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary Neurotrophic Factor,CNTF)是一種可以促進多種神經(jīng)元分化和存活,阻止神經(jīng)元退變并保護神經(jīng)元免受損傷的神經(jīng)活性蛋白,1984年由Barbin等從雞胚睫狀體、脈絡膜、虹膜中提取獲得,因其能維持副交感神經(jīng)節(jié)的存活并對睫狀節(jié)神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用而得名。CNTF最突出的作用是維持中樞和周圍運動神經(jīng)元的生物活性,可以促進多種神經(jīng)元的存活和分化,抑制神經(jīng)元受損后的退變。正常大鼠的脊髓可以表達

2、少量的CNTF,且損傷后在中樞及周圍神經(jīng)損傷局部會發(fā)生暫時性的表達上調(diào),但其難以達到對抗神經(jīng)損傷的水平。隨著分子生物學和基因工程技術的快速發(fā)展,利用復制缺陷型重組腺病毒(Adcnovirus,AdV)將編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因?qū)氲桨屑毎徒M織中,以期得到穩(wěn)定持久的表達已成為神經(jīng)損傷修復領域新的研究方向。本實驗將攜帶有CNTF的復制缺陷型腺病毒(AdCNTF)和不攜帶任何外源基因的復制缺陷型腺病毒(AdO)分別導入大鼠脊髓腰膨大中,觀察腺

3、病毒介導的外源性CNTF基因在大鼠脊髓的表達水平,以探討這一基因治療新途徑。
　　 方法:將7周齡、體重200-250g的健康Wistar大鼠126只隨機分至三組當中。其中正常對照組(A組)42只,正常飼養(yǎng)不予處理;實驗對照組(B組)42只,導入不攜帶外源基因的重組腺病毒載體AdO;實驗組(C組)42只導入攜帶外源性CNTF基因的重組腺病毒載體AdCNTF。腹腔注射10％水合氯醛麻醉,麻醉成功后將大鼠固定于立體定位儀上,切取長約

4、2cm后正中縱切口,逐層切開并分離椎旁肌肉顯露T13椎板及棘突,仔細咬除T13椎板后明膠海綿輕微壓迫止血。微量注射器迅速吸取1μL病毒液,于T13脊髓后正中動脈稍偏右0.8mm處,斜向頭端45°刺入,進針長度約2.5mm,緩慢推送1μL/min。實驗對照組(B組)注入AdO,實驗組(C組)注入AdCNTF,完畢滯針2min后緩慢拔針。充分止血,生理鹽水沖洗后局部應用抗生素,關閉傷口。三組大鼠在B、C組注射腺病毒后2天、7天、2周、4周、

5、6周、8周、10周時取材。將同一時間點不同組別的wistar大鼠(6只)其中3只經(jīng)多聚甲醛灌注后取出脊髓腰膨大節(jié)段。另外3只大鼠在麻醉后不進行灌注直接取出脊髓腰膨大節(jié)段,凍存于-70℃冰箱中留備RT-PCR實驗之用。分別對三組大鼠不同時間點的脊髓灌注標本進行40μm連續(xù)振動切片,進行CNTF免疫組化實驗,計數(shù)脊髓前角CNTF陽性細胞數(shù)目。對凍存標本進行RT-PCR實驗,逆轉(zhuǎn)錄脊髓組織中的CNTFmRNA,并以β-actin為內(nèi)參照,計算

6、CNTFmRNA的相對表達量。所測數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理,以x-±s表示,首先對三組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗,若方差齊同則應用LSD-t檢驗進行同一時間點組間兩兩比較,方差不齊采用Kruskal-Wills H檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1 CNTF基因在大鼠脊髓中的表達趨勢
　　 脊髓切片CNTF免疫組化檢測顯示A組(正常對照組)組內(nèi)不同時間點陽性細胞計數(shù)比較均無顯著差

7、異(P＞0.05),認為A組CNTF表達量不具有隨時間變化的趨勢;B組(實驗對照組)手術導入脊髓空白腺病毒AdO后第2天CNTF表達量增加,第7天達高峰,2周時CNTF降至正常水平,在第2周及以后時間點與A組(正常對照組)比較無顯著差異(P＞0.05);C組(實驗組)在手術導入脊髓攜帶有CNTF基因的AdCNTF后第2天CNTF表達量增加,表達高峰同為第7天,此后逐漸下降,至第8周時降至正常水平,且C組的CNTF表達量在第2天、7天、2

8、周、4周、6周時均高于同時間點B組和A組。統(tǒng)計分析顯示:在手術導入腺病毒后第2天、7天,三組兩兩比較均有顯著差異(P＜0.05);在第2周、4周、6周,B、C組與A組(正常對照組)比較,C組與其有顯著差異(p＜0.05);在第8周、10周,三組兩兩比較均無顯著差異(p＞0.05)。
　　 2 脊髓標本腺病毒PCR檢測
　　 利用腺病毒特異性引物對腺病毒10×梯度稀釋液中的DNA進行擴增,測出AdCNTF與AdO具有共同的

9、最低稀釋度104。在不同時間點對B組(實驗對照組)和C組(實驗組)脊髓標本中腺病毒DNA進行檢測,發(fā)現(xiàn)腺病毒DNA含量隨時間下降,導入后第10周已測不到腺病毒DNA。
　　 3 CNTF mRNA表達趨勢
　　 用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(RT-PCR)檢測CNTF mRNA在正常對照組(A組)、實驗對照組(B組)、實驗組(C組)中的變化趨勢:正常對照組(A組)存在低水平的CNTF mRNA表達,表達量不隨時間變化;實驗對照組(

10、B組)在手術導入無外源基因的腺病毒AdO2天后,與同時間點正常對照組(A組)比較CNTF mRNA表達量增多,第7天達到高峰,2周時降至正常水平;實驗組(C組)手術導入攜帶有CNTF基因的腺病毒.AdCNTF后2天可檢測到CNTF mRNA升高,表達高峰同為第7天,此后呈下降趨勢,至第8周時降至正常水平。在第2天、7天、2周、4周、6周時C組CNTF mRNA表達量均高于同時間點實驗對照組(B組)和正常對照組(A組)。統(tǒng)計分析顯示:手術

11、導入病毒后第2天、7天時三組兩兩比較均有顯著差異(P＜0.05),第2周、4周、6周時另兩組與A組(正常對照組)比較,C組與其有顯著差異(p＜0.05),8周、10周時三組兩兩比較均無顯著差異(p＞0.05)。
　　 結論:正常大鼠脊髓組織中即存在低水平的內(nèi)源性CNTF表達。大鼠脊髓在導入不攜帶外源基因的腺病毒AdO后,內(nèi)源性CNTF表達水平較正常大鼠短暫增高,這是由于腺病毒引起的炎性刺激、免疫反應及手術造模過程對脊髓造成了損傷