AAV9介導VEGF基因過表達對mdx小鼠的影響.pdf

1、目的：Duchenne型肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophin,DMD）是一種X連鎖隱性遺傳致死性肌肉病，在存活男嬰中的發(fā)病率約為1/3500。以進行性加重的對稱性肌肉無力和萎縮為主要臨床特征，患者一般6-12歲喪失行走能力，20歲左右死于心肺衰竭。
　　DMD患者發(fā)病是由DMD基因突變導致dystrophin蛋白缺失引起。Dystrophin蛋白，一方面，作為細胞膜骨架維持肌細胞的完整性與穩(wěn)定性，對

2、抗機械收縮對細胞造成的損傷；另一方面dystrophin蛋白有信號轉(zhuǎn)導的作用包括機械力的傳導，以及聚集一些信號轉(zhuǎn)導蛋白參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。Dystrophin蛋白缺失導致肌纖維對機械和化學損傷更加敏感，同時引起肌細胞內(nèi)信號通路紊亂，進而通過各種機制，如細胞內(nèi)鈣超載、氧化應激、炎癥反應、自噬凋亡等導致肌組織中大量炎細胞浸潤、肌纖維壞死，最終由脂肪和纖維結締組織代替。
　　DMD的致病基因二十多年前就已經(jīng)被確定，但直到現(xiàn)在仍無有效的治

3、療辦法。雖然基因治療為DMD患者提供了希望，但真正用于DMD的臨床治療并且達到治愈的目的還有很多難以克服的障礙。經(jīng)過多年的研究探索，我們對DMD的病理生理機制已經(jīng)有了很好的理解。因此，我們可以通過干預促進肌營養(yǎng)不良發(fā)生發(fā)展的細胞和分子機制，減慢DMD患者疾病進展、改善臨床癥狀。
　　血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是生理性和病理性血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，涉及調(diào)節(jié)血管

4、生成，促肌細胞再生，改善灌注等多種生物學作用。已有研究證實，在肌肉損傷性疾病模型中， VEGF可以減少肌肉損傷，促進肌再生。近年來，以血管為靶點的治療，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI），用于改善DMD患者心臟功能及系統(tǒng)性血管舒張能力，臨床試驗已證明了其有效性。所以 VEGF是否能減緩DMD患者的疾病進展，改善臨床癥狀，值得我們進一步探索。
　　mdx小鼠是DMD研究的經(jīng)典動物模型，由C57BL/10小鼠DMD基因自發(fā)點突變形成

5、。本實驗以 AAV9為載體攜帶 VEGF基因，經(jīng)尾靜脈注射入mdx小鼠體內(nèi)，使mdx小鼠體內(nèi)VEGF過表達，從而進一步探討VEGF能否改善mdx小鼠的肌肉組織病理及肌肉功能。
　　方法：我們的前期實驗觀察到mdx小鼠在8w時肌肉病理改變最為嚴重，在本實驗中我們首先進一步對8w mdx小鼠的肌肉損傷進行了評估，為后續(xù)實驗提供數(shù)據(jù)參考及客觀可行的評估方案。
　　1.觀察8周齡mdx小鼠的血清學、病理學和肌力改變。選取8w雄性C5

6、7BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠（以下簡稱mdx小鼠）為實驗鼠（mdx組），8w雄性野生型小鼠（C57BL/10ScSn小鼠）為對照鼠(wt組）。每組選取10只，5只用于前肢握力檢測及留取血清標本；5只用于后肢肌力檢測及常規(guī)組織化學染色。選取5只小鼠，測量前肢抓力，然后以10％水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉，摘除小鼠眼球取血，留取血清標本，用于血清CK值測定；另外選取5只小鼠，以10%水合氯醛(350mg/K

7、g體重)腹腔注射麻醉，分離脛骨前肌，對其收縮功能進行原位分析，分析完成后，移除脛骨前肌稱重。取小鼠脛骨前肌進行包埋冰凍處理或直接冰凍處理。通過冰凍切片的常規(guī)染色（HE染色）觀察肌組織病理改變，并對肌纖維再生及壞死情況進行評估。
　　2.觀察AAV9介導的VEGF基因過表達對mdx小鼠的影響。
　　2.1 驗證在本實驗室條件下AAV9所攜帶基因能在小鼠體內(nèi)進行表達。選取3對6w同窩雄性野生型小鼠，3只未給予任何處理，作為空白對

8、照；3只給予AAV9-GFP（150ul/只1x1012vg/mL）尾靜脈注射，單次注射后3周，在激光共聚焦顯微鏡下觀察肌肉組織中綠色熒光蛋白GFP（green fluorescent protein,GFP）的表達情況。
　　2.2 選取6w雄性野生型小鼠為正常對照組（wt組）；選取6w雄性mdx小鼠，分為兩組：mdx組（不給與任何處理），AAV9-VEGF組（給予AAV9-VEGF150ul/只，尾靜脈注射），每組5只小鼠。單

9、次給藥后觀察4w，在小鼠10w時對其進行肌損傷程度的定量評估。評估方法同上。應用spss13.0系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行分析。
　　結果：
　　1.8w mdx小鼠的血清學、病理學和肌力改變。
　　1.1 血清CK水平：mdx小鼠血清CK水平較wt組明顯升高。
　　1.2 肌肉病理：HE染色中，mdx小鼠脛骨前肌、腓腸肌及膈肌中心核肌纖維比例與wt組相比明顯升高。mdx小鼠脛骨前肌、膈肌肌纖維最小Feret直徑變異度明顯大

10、于wt組。mdx小鼠脛骨前肌、腓腸肌及膈肌炎癥壞死區(qū)域占總面積的百分比明顯高于wt組。
　　1.3 肌力：小鼠抓力測試中，mdx小鼠5次重復測量的肌力均小于wt組；第5次測量的肌力和第1次測量的肌力相比，其下降的百分率約為56%，明顯高于wt組。脛骨前肌收縮功能的原位分析：在不同頻率下mdx小鼠所測定的最大強直收縮力均小于wt組；連續(xù)9次離心收縮后所測得的最大等長收縮力和初始的最大等長收縮力相比，其下降的百分率約為80%，明顯高于

11、wt組。
　　2. AAV9介導VEGF基因過表達改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能。
　　2.1 wt組小鼠經(jīng)尾靜脈注射AAV9-GFP后，觀察到其肌肉組織中有綠色熒光蛋白的表達。驗證了在本實驗室條件下AAV9可以成功的轉(zhuǎn)染肌細胞并表達所攜帶的基因。
　　2.2 Westren blotting結果表明與wt組、mdx組相比，AAV9-VEGF組小鼠肌肉組織中VEGF含量升高。
　　2.3 AAV9-VEGF

12、組、mdx組、wt組肌肉損傷程度定量比較。
　　2.3.1 血清CK水平：AAV9-VEGF組血清CK水平（46249.5U/L）較mdx組降低（73418U/L），較wt組升高（2746.5U/L），差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.3.2 肌肉病理：HE染色中，AAV9-VEGF組小鼠炎癥壞死區(qū)域占總面積的百分比為0.992±0.22%，低于mdx組，高于wt組，差異均有統(tǒng)計學意義；AAV9-VEGF組再生肌纖維數(shù)目占總纖維數(shù)

13、的百分比27.97±3.3%，高于mdx組，差異無統(tǒng)計學意義；高于wt組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.3.3 肌力：AAV9-VEGF組小鼠5次重復測量的肌力均小于wt組，大于mdx組，差異均有統(tǒng)計學意義；第5次測量的肌力和第1次測量的肌力相比，AAV9-VEGF組下降的百分率約為57%，高于wt組，低于mdx組，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　結論：VEGF能在一定程度上改善mdx小鼠的肌組織損傷，為DMD提供了新的治療方向，如