AAV9介導(dǎo)VEGF基因過(guò)表達(dá)對(duì)mdx小鼠的影響.pdf

1、目的：Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophin,DMD）是一種X連鎖隱性遺傳致死性肌肉病，在存活男嬰中的發(fā)病率約為1/3500。以進(jìn)行性加重的對(duì)稱性肌肉無(wú)力和萎縮為主要臨床特征，患者一般6-12歲喪失行走能力，20歲左右死于心肺衰竭。
　　DMD患者發(fā)病是由DMD基因突變導(dǎo)致dystrophin蛋白缺失引起。Dystrophin蛋白，一方面，作為細(xì)胞膜骨架維持肌細(xì)胞的完整性與穩(wěn)定性，對(duì)

2、抗機(jī)械收縮對(duì)細(xì)胞造成的損傷；另一方面dystrophin蛋白有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用包括機(jī)械力的傳導(dǎo)，以及聚集一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Dystrophin蛋白缺失導(dǎo)致肌纖維對(duì)機(jī)械和化學(xué)損傷更加敏感，同時(shí)引起肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路紊亂，進(jìn)而通過(guò)各種機(jī)制，如細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬凋亡等導(dǎo)致肌組織中大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肌纖維壞死，最終由脂肪和纖維結(jié)締組織代替。
　　DMD的致病基因二十多年前就已經(jīng)被確定，但直到現(xiàn)在仍無(wú)有效的治

3、療辦法。雖然基因治療為DMD患者提供了希望，但真正用于DMD的臨床治療并且達(dá)到治愈的目的還有很多難以克服的障礙。經(jīng)過(guò)多年的研究探索，我們對(duì)DMD的病理生理機(jī)制已經(jīng)有了很好的理解。因此，我們可以通過(guò)干預(yù)促進(jìn)肌營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞和分子機(jī)制，減慢DMD患者疾病進(jìn)展、改善臨床癥狀。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是生理性和病理性血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，涉及調(diào)節(jié)血管

4、生成，促肌細(xì)胞再生，改善灌注等多種生物學(xué)作用。已有研究證實(shí)，在肌肉損傷性疾病模型中， VEGF可以減少肌肉損傷，促進(jìn)肌再生。近年來(lái)，以血管為靶點(diǎn)的治療，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI），用于改善DMD患者心臟功能及系統(tǒng)性血管舒張能力，臨床試驗(yàn)已證明了其有效性。所以 VEGF是否能減緩DMD患者的疾病進(jìn)展，改善臨床癥狀，值得我們進(jìn)一步探索。
　　mdx小鼠是DMD研究的經(jīng)典動(dòng)物模型，由C57BL/10小鼠DMD基因自發(fā)點(diǎn)突變形成

5、。本實(shí)驗(yàn)以 AAV9為載體攜帶 VEGF基因，經(jīng)尾靜脈注射入mdx小鼠體內(nèi)，使mdx小鼠體內(nèi)VEGF過(guò)表達(dá)，從而進(jìn)一步探討VEGF能否改善mdx小鼠的肌肉組織病理及肌肉功能。
　　方法：我們的前期實(shí)驗(yàn)觀察到mdx小鼠在8w時(shí)肌肉病理改變最為嚴(yán)重，在本實(shí)驗(yàn)中我們首先進(jìn)一步對(duì)8w mdx小鼠的肌肉損傷進(jìn)行了評(píng)估，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考及客觀可行的評(píng)估方案。
　　1.觀察8周齡mdx小鼠的血清學(xué)、病理學(xué)和肌力改變。選取8w雄性C5

6、7BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠（以下簡(jiǎn)稱mdx小鼠）為實(shí)驗(yàn)鼠（mdx組），8w雄性野生型小鼠（C57BL/10ScSn小鼠）為對(duì)照鼠(wt組）。每組選取10只，5只用于前肢握力檢測(cè)及留取血清標(biāo)本；5只用于后肢肌力檢測(cè)及常規(guī)組織化學(xué)染色。選取5只小鼠，測(cè)量前肢抓力，然后以10％水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉，摘除小鼠眼球取血，留取血清標(biāo)本，用于血清CK值測(cè)定；另外選取5只小鼠，以10%水合氯醛(350mg/K

7、g體重)腹腔注射麻醉，分離脛骨前肌，對(duì)其收縮功能進(jìn)行原位分析，分析完成后，移除脛骨前肌稱重。取小鼠脛骨前肌進(jìn)行包埋冰凍處理或直接冰凍處理。通過(guò)冰凍切片的常規(guī)染色（HE染色）觀察肌組織病理改變，并對(duì)肌纖維再生及壞死情況進(jìn)行評(píng)估。
　　2.觀察AAV9介導(dǎo)的VEGF基因過(guò)表達(dá)對(duì)mdx小鼠的影響。
　　2.1 驗(yàn)證在本實(shí)驗(yàn)室條件下AAV9所攜帶基因能在小鼠體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。選取3對(duì)6w同窩雄性野生型小鼠，3只未給予任何處理，作為空白對(duì)

8、照；3只給予AAV9-GFP（150ul/只1x1012vg/mL）尾靜脈注射，單次注射后3周，在激光共聚焦顯微鏡下觀察肌肉組織中綠色熒光蛋白GFP（green fluorescent protein,GFP）的表達(dá)情況。
　　2.2 選取6w雄性野生型小鼠為正常對(duì)照組（wt組）；選取6w雄性mdx小鼠，分為兩組：mdx組（不給與任何處理），AAV9-VEGF組（給予AAV9-VEGF150ul/只，尾靜脈注射），每組5只小鼠。單

9、次給藥后觀察4w，在小鼠10w時(shí)對(duì)其進(jìn)行肌損傷程度的定量評(píng)估。評(píng)估方法同上。應(yīng)用spss13.0系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.8w mdx小鼠的血清學(xué)、病理學(xué)和肌力改變。
　　1.1 血清CK水平：mdx小鼠血清CK水平較wt組明顯升高。
　　1.2 肌肉病理：HE染色中，mdx小鼠脛骨前肌、腓腸肌及膈肌中心核肌纖維比例與wt組相比明顯升高。mdx小鼠脛骨前肌、膈肌肌纖維最小Feret直徑變異度明顯大

10、于wt組。mdx小鼠脛骨前肌、腓腸肌及膈肌炎癥壞死區(qū)域占總面積的百分比明顯高于wt組。
　　1.3 肌力：小鼠抓力測(cè)試中，mdx小鼠5次重復(fù)測(cè)量的肌力均小于wt組；第5次測(cè)量的肌力和第1次測(cè)量的肌力相比，其下降的百分率約為56%，明顯高于wt組。脛骨前肌收縮功能的原位分析：在不同頻率下mdx小鼠所測(cè)定的最大強(qiáng)直收縮力均小于wt組；連續(xù)9次離心收縮后所測(cè)得的最大等長(zhǎng)收縮力和初始的最大等長(zhǎng)收縮力相比，其下降的百分率約為80%，明顯高于

11、wt組。
　　2. AAV9介導(dǎo)VEGF基因過(guò)表達(dá)改善了mdx小鼠的肌肉病理及肌肉功能。
　　2.1 wt組小鼠經(jīng)尾靜脈注射AAV9-GFP后，觀察到其肌肉組織中有綠色熒光蛋白的表達(dá)。驗(yàn)證了在本實(shí)驗(yàn)室條件下AAV9可以成功的轉(zhuǎn)染肌細(xì)胞并表達(dá)所攜帶的基因。
　　2.2 Westren blotting結(jié)果表明與wt組、mdx組相比，AAV9-VEGF組小鼠肌肉組織中VEGF含量升高。
　　2.3 AAV9-VEGF

12、組、mdx組、wt組肌肉損傷程度定量比較。
　　2.3.1 血清CK水平：AAV9-VEGF組血清CK水平（46249.5U/L）較mdx組降低（73418U/L），較wt組升高（2746.5U/L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3.2 肌肉病理：HE染色中，AAV9-VEGF組小鼠炎癥壞死區(qū)域占總面積的百分比為0.992±0.22%，低于mdx組，高于wt組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AAV9-VEGF組再生肌纖維數(shù)目占總纖維數(shù)

13、的百分比27.97±3.3%，高于mdx組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高于wt組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3.3 肌力：AAV9-VEGF組小鼠5次重復(fù)測(cè)量的肌力均小于wt組，大于mdx組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第5次測(cè)量的肌力和第1次測(cè)量的肌力相比，AAV9-VEGF組下降的百分率約為57%，高于wt組，低于mdx組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：VEGF能在一定程度上改善mdx小鼠的肌組織損傷，為DMD提供了新的治療方向，如