毛竹再生體系構建的初步研究.pdf

1、毛竹是我國竹子中最重要的竹種，栽培面積最大和經濟效益最好，但其生物學特性導致種質資源創(chuàng)新困難。近年來隨著竹產業(yè)迅速發(fā)展和轉基因技術日益成熟，適合毛竹工業(yè)化利用的無性系創(chuàng)制在技術上和產業(yè)化上成為可能，穩(wěn)定的再生體系構建是毛竹轉基因育種不可缺少的技術平臺。本研究通過對竹筍、種胚等外植體材料進行了種胚消毒、愈傷組織誘導、增殖、分化及懸浮培養(yǎng)、細胞學觀察等研究，結論如下：
　　1.毛竹鞭筍、冬筍、春筍等外植體消毒較容易，選擇籜包裹緊實的筍

2、體，經過75％乙醇消毒后在超凈臺下剝取無菌部分就可以獲得滿意的無菌得率，無菌得率高達95%以上，偶有個別細菌污染。
　　種胚消毒較困難，次氯酸鈣類消毒劑對種子活力影響明顯，抗生素消毒效果差不能殺死種子上的微生物，過氧化氫也不適合種胚消毒，以0.1%升汞消毒效果最好。毛竹種胚最佳的消毒處理為：種胚預處理，去掉尾部容易污染部分，浸種12h后，采取0.1%升汞消毒20min，無菌水漂洗10遍。這樣可以獲得較為滿意的消毒效果，污染基本為一

3、種單一真菌污染，極少有細菌和其他雜菌污染，可能是附著在種胚表面的優(yōu)勢真菌導致消毒困難。
　　隔年陳種子因生活力顯著下降一般不宜作為外植體，種子采集時間早種胚尚未發(fā)育完全，污染率低同時種胚發(fā)芽率也低。不同溫度的熱處理對種子活力影響很大，種子幾乎全部喪失生活力，同時對改善嚴重污染沒有幫助作用。
　　2.毛竹筍（鞭筍、冬筍、春筍等）及筍籜外植體誘導愈傷組織較易，誘導率高達100%，但質量不高，沒有獲得緊實的胚性愈傷組織，愈傷組織水

4、漬化嚴重，繼代培養(yǎng)時嚴重褐變，各種措施均無法挽救，細胞學檢查表明多數細胞缺失細胞核。放置方式和切割方式對愈傷組織誘導沒有影響，接觸培養(yǎng)基部分容易產生愈傷組織；在誘導速度上春筍較快，鞭筍次之，冬筍反應相對較慢。
　　毛竹種胚誘導的愈傷組織可以分為兩種類型，一類是緊實的胚性愈傷組織，一類是疏松的非胚性愈傷組織。切割方式對愈傷組織誘導的影響明顯，橫切方式由于切除了種胚的胚根組織，對控制胚根部位產生疏松易褐變愈傷組織有幫助，更容易產生胚性

5、愈傷組織；在兩種放置方式中，盾片朝下接觸培養(yǎng)基能夠獲得較高的愈傷組織誘導率。胚性愈傷組織一般產生在根莖結合部位或者盾片部位，顏色淡黃色，用鑷子夾取時感覺緊實；非胚性愈傷組織一般源自根部，顏色發(fā)白或紫褐色，松軟，用鑷子夾取易碎，水漬狀明顯。
　　3.毛竹筍（包括春筍、冬筍、鞭筍及其筍籜）誘導的愈傷組織分化培養(yǎng)中容易褐變，在各種條件下均沒有出現分化跡象，其增殖培養(yǎng)也不成功。
　　在種胚誘導的愈傷組織中，因含有胚性愈傷組織，尚有個

6、別出現分化跡象，但沒有獲得再生植株，增殖培養(yǎng)中，除個別非胚性愈傷組織能夠實現正常增殖外，胚性愈傷組織存在褐變嚴重，生長速度慢，對各種培養(yǎng)條件調整不敏感，無論轉接與否，胚性愈傷組織都不可逆朝著死亡褐變方向發(fā)展。
　　按照存活數統計，脯氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、椰乳等有機添加物可以提高存活數，但酵母效果不明顯，筍汁添加反而使存活數下降；糖的種類對愈傷組織影響不是很大，除甘露糖之外，葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖對愈傷組織存活影響相

7、差無幾。培養(yǎng)基中除N6培養(yǎng)基效果較差外，MS、CC、WC、NB、KM8P等培養(yǎng)基對愈傷組織繼代培養(yǎng)影響效果相當。
　　4.毛竹非胚性愈傷組織的懸浮培養(yǎng)結果表明，培養(yǎng)基中2,4-D濃度變化對愈傷組織增殖影響不是很大，愈傷組織在懸浮培養(yǎng)液中需要長達12d增殖速度才變快，接種量雖能使愈傷組織增殖提前，但效果不明顯，研究發(fā)現毛竹非胚性愈傷組織對外界條件反應不敏感且在懸浮培養(yǎng)條件下增殖速度慢。
　　5.細胞學觀察結果表明，在毛竹幾種不