“輻選01”木薯再生體系的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立.pdf

1、以木薯品種“輻選01”的腋芽為外植體，建立無性快繁體系，主要研究外植體滅菌方法、初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及應(yīng)對(duì)無菌芽玻璃化的方法;以無菌芽葉片為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法初步建立木薯品種“輻選01”的遺傳轉(zhuǎn)化體系。具體研究結(jié)果如下:
　　1.快繁體系建立
　　滅菌:大田、水培及沙培莖段均以75.0％酒精滅菌30 s后配合0.1％ HgCl2進(jìn)行滅菌，各處理適宜的HgCl2滅菌時(shí)間為:大田有髓處理13min、無髓處

2、理10min，大棚沙培有髓處理11min、無髓處理9min，室內(nèi)水培處理以6min為宜。
　　初代培養(yǎng):添加KT的處理的萌芽率要比添加6-BA和TDZ的高，但是芽長(zhǎng)勢(shì)卻比添加6-BA處理的弱;TDZ的添加加劇了芽的玻璃化現(xiàn)象;綜合考慮萌芽率及芽長(zhǎng)勢(shì)，初代培養(yǎng)以MS+1.0 mg/L6-BA培養(yǎng)基為佳。
　　繼代增殖培養(yǎng):在單因素試驗(yàn)中，6-BA處理對(duì)芽增殖系數(shù)及長(zhǎng)勢(shì)的影響都要優(yōu)于KT和TDZ處理，當(dāng)6-BA為0.5 mg/L

3、時(shí)芽增殖系數(shù)為2.5;在雙因素試驗(yàn)中MS+1.0 mg/L6-BA+0.05 mg/L NAA處理的增殖系數(shù)為3.2，且形成的芽壯而整齊，較適宜于繼代增殖培養(yǎng)。
　　生根培養(yǎng):NAA、IBA、IAA、MET均可誘導(dǎo)不定芽生根，結(jié)合生根率、單株平均根數(shù)及移栽等方面考慮，在本試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中以MS+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基較適宜于“輻選01”木薯無菌芽的生根培養(yǎng)。
　　移栽∶草炭∶珍珠巖∶蛭石(1∶1∶1)基質(zhì)中組培苗的移栽死

4、亡率在30 d后為75％，要低于其他兩個(gè)處理，較適宜于作為木薯品種輻選“輻選01”組培苗的移栽基質(zhì)。
　　2.再生體系的建立
　　在本次試驗(yàn)中適宜于木薯品種“輻選01”葉片誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為:MS+12.0 mg/L Piclorarn+0.2 mg/LCuSO4;愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+10.0mg/L Picloram+0.2 mg/L CuSO4;愈傷組織分化出芽的培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L6-BA+4.0

5、mg/L AgNO3。
　　3.遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立
　　以MS+12.0 mg/L Picloram+0.2 mg/L CuSO4為基本培養(yǎng)基，添10～200mg/L的卡那霉素（Km）對(duì)無菌芽的葉片進(jìn)行抗性壓篩選，結(jié)果表明葉片Km抗性壓篩選的適宜濃度為150mg/L。
　　對(duì)經(jīng)過攜帶目的基因農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后的葉盤進(jìn)行熒光鏡檢，結(jié)果表明，在3d共培養(yǎng)下，農(nóng)桿菌侵染無菌葉片的侵染時(shí)間以15min為好，侵染率為50.