犬細(xì)小病毒（CPV）的分離鑒定及其卵黃抗體（IgY）治療制劑的研制.pdf

1、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)是一種引起犬出血性腸炎或心肌炎的單鏈線狀DNA病毒。據(jù)石河子獸醫(yī)防疫部門統(tǒng)計(jì),在當(dāng)?shù)厝母鞣N傳染病中,犬細(xì)小病毒性腸炎發(fā)病率、死亡率均為最高,為犬的主要傳染病之一。目前該病還沒(méi)有有效的治療藥物,開發(fā)CPV抗體及其診斷、治療試劑將有助于該病的防治。 本研究從臨床疑似犬細(xì)小病毒感染病死犬的內(nèi)臟中分離CPV,應(yīng)用F81貓?zhí)ツI傳代細(xì)胞增毒,Sepharose-4B層析與Fracto

2、gel* EMD TMAE(M)強(qiáng)陰離子交換層析相結(jié)合的方法純化病毒,對(duì)分離病毒用常規(guī)方法血凝及血凝抑制、免疫電鏡和PCR法予以確認(rèn)。繼而以純化的CPV作為抗原免疫健康產(chǎn)蛋雞,收集雞蛋,用改良PEG6000法和水稀釋法提取卵黃抗體(IgY)。用瓊脂擴(kuò)散法和間接ELISA法測(cè)定IgY效價(jià)以及體外中和病毒效價(jià)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,以純化的CPV毒株實(shí)驗(yàn)室人工攻毒感染2～3月齡幼犬5只,待出現(xiàn)明顯臨床癥狀時(shí),用特異卵黃抗體進(jìn)行治療,考察其療效。進(jìn)而

3、在石河子獸醫(yī)門診臨床治療發(fā)病犬,從較大樣本中統(tǒng)計(jì)治愈率。 研究結(jié)果顯示,分離CPV的接種F81細(xì)胞產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變,凝集豬紅細(xì)胞效價(jià)達(dá)29,并能被犬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清所抑制；免疫電鏡觀察外觀呈圓形、直徑約20～24nm病毒粒子；根據(jù)犬細(xì)小病毒的基因組設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到犬細(xì)小病毒VP2基因組全長(zhǎng),提交GenBank(EU170352),經(jīng)序列分析,確定分離毒株為CPV-2a型。暫命名為CPV-SHZ株。改良PEG600

4、0法提取IgY的蛋白濃度高,而水提法IgY純度高。瓊脂擴(kuò)散法與間接ELISA法測(cè)定IgY最后一次免疫后10天的效價(jià)分別為1:32和1:24000。實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和較大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)分別獲得100％和79.4％的治愈率和明顯的動(dòng)物保護(hù)效果。 本研究在新疆石河子地區(qū)成功分離到犬細(xì)小病毒CPV-SHZ株,為我國(guó)該病流行病學(xué)提供一定的參考資料,并且針對(duì)該病原體制備了高效價(jià)的IgY抗體,應(yīng)用抗體的中和特性,臨床治療效果顯著。所得抗體經(jīng)