黃芩苷對糖氧剝奪誘導內皮細胞凋亡與壞死的保護作用.pdf

1、隨著老年化進程加快，癡呆的患病率急劇上升，相較于我過龐大的人口基數(shù)，癡呆逐漸成為我國一個重要的公共健康問題。癡呆主要分為三種類型:阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)以及混合性癡呆。在全世界的癡呆患者中，血管性癡呆大約占20％;并且在亞洲患血管性癡呆人數(shù)已經超過了阿爾茨海默病患者。血管性癡呆患者的5年生存壽命低于阿爾茨海默病，同時老齡化加快心腦血管疾病成為危

2、害國民健康的第一大問題，對血管性癡呆的研究重要性也越發(fā)顯現(xiàn)。長期以來，廣大科研工作者致力于該疾病的機制及防治研究，雖取得了較大進展，但目前仍缺乏有效干預和防治該疾病的藥物或措施。
　　黃芩是一味具有悠久歷史的傳統(tǒng)中藥，能清熱解毒，燥濕止血?，F(xiàn)代的藥理學研究表明黃芩還有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多種藥理作用。黃芩苷(Baicalin)，黃芩根里提取出來的黃酮類化合物，是比較重要的藥理活性成分。在許多的研究顯示，黃芩苷具有抗氧化、抗

3、炎等作用，能夠改善有心肌缺血損害。
　　目的:
　　本實驗以缺糖缺氧誘導小鼠腦微血管內皮細胞(bEnd.3 cell)損害，建立糖氧剝奪模型(oxygen-glucose deprivation，OGD)，模擬腦缺血缺氧損害病理。研究黃芩苷對小鼠腦微血管內皮細胞糖氧剝奪誘導凋亡和壞死的保護作用。
　　方法:
　　1.構建糖氧剝奪模型(OGD)，將貼壁好的內皮細胞，通過置換無糖培養(yǎng)基，放入定制的無氧裝置，運用MTT

4、法檢測證明模型建立成功與穩(wěn)定。
　　2.通過MTT法、LDH法證明黃芩苷對糖氧剝奪誘導細胞損害有保護作用;
　　3.通過流式檢測方法檢測黃芩苷(100μM)對糖氧剝奪誘導bEnd.3細胞晚期凋亡、壞死的影響
　　4.透射電鏡、Hoechst33258/PI雙染法分別觀察黃芩苷對糖氧剝奪誘導bEnd.3細胞損害形態(tài)改變影響;
　　5.通過ROS測定驗證黃芩苷具有抗氧化作用進一步說明黃芩苷對糖氧剝奪誘導細胞損害的保護

5、作用。
　　結果:
　　1.OGD模型構建
　　OGD誘導小鼠腦微血管內皮細胞在2、4、6h損害明顯，在2、4、6h三個時間的細胞存活率的百分數(shù)分別為((x)±s):62.31±2.91、48.32±0.49、36.95±6.46，模型組細胞存活率低于對照組比較(p＜0.05)。
　　2.黃芩苷對OGD誘導bEnd.3細胞損傷的保護作用
　　黃芩苷對OGD誘導2、4、6 h bEnd.3細胞損傷的保護作用。

6、在2、4、6h三個時間點中，模型組細胞存活率低于正常對照組(p＜0.05)，黃芩苷100μ M和200μM組，與模型組比較，藥物對細胞有明顯保護作用(p＜0.05)。
　　黃芩苷對OGD誘導2、4、6 h bEnd.3細胞上清液LDH含量影響，與對照組比較，模型組細胞上清液LDH含量增加(p＜0.05)、與模型組比較，黃芩苷100μ M和200μ M組細胞上清LDH漏出量降低(p＜0.05)。特別在誘導6h后，與模型組比較，用藥組

7、細胞上清液LDH含量減少明顯(p＜0.05)。
　　3.黃芩苷抗凋亡作用:Annexin-Ⅴ-FITC流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組Annexin-Ⅴ（+/-）/PI(+)ratio增加明顯，細胞晚期凋亡和壞死多，(p＜0.05);與模型組組比較，黃芩苷組Annexin-Ⅴ（+/-）/PI(+)明顯減少，對細胞晚期凋亡和壞死有減少，對細胞有保護作用，有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　4.Hoechst33258/

8、PI熒光雙染檢測
　　黃芩苷對糖氧剝奪6 h bEnd.3細胞Hoechst33258/PI熒光雙染檢測結果:與正常組比較，模型組同時染上兩種染料的細胞明顯多，表示壞死和晚期凋亡細胞增加;與模型組比較，黃芩苷100μM組細胞雙染少，壞死和晚期凋亡細胞少。
　　糖氧剝奪誘導2、4、6h以及黃芩苷對bEnd.3細胞形態(tài)改變實驗結果:糖氧剝奪損害2、4、6h，2、4h細胞空泡逐漸增多，存在凋亡;6h細胞質融解，核碎裂細胞壞死。加入

9、黃芩苷100μM細胞形態(tài):細胞膜、細胞核、細胞器完整，與OGD損害6h比較，細胞形態(tài)比較完整，黃芩苷保護作用較明顯。
　　5.黃芩苷對OGD誘導6 h bEnd.3細胞內ROS含量結果:OGD6h模型組組與正常組比較，ROS含量增加明顯;黃芩苷100μM組與模型組比較細胞內ROS產生明顯減少。
　　結論:
　　1.OGD誘導bEnd.3細胞損害明顯，且細胞損害程度隨時間增加而損害增加的趨勢，OGD誘導損害模型穩(wěn)定，能達

10、到預期實驗損害要求
　　2.黃芩苷能明顯減少糖氧剝奪誘導bEnd.3細胞損害的作用，保護作用沒有明顯的藥物劑量依賴的現(xiàn)象。同時能減少細胞上清液中LDH的含量，并且黃芩苷對減少細胞上清液中LDH的含量在糖氧剝奪誘導6h作用最明顯。
　　3.黃芩苷能明顯減少糖氧剝奪誘導bEnd.3細胞晚期凋亡和壞死。
　　4.黃芩苷能減少糖氧剝奪誘導bEnd.3細胞壞死，維持細胞生理結構的穩(wěn)定。
　　5.黃芩苷能明顯減少糖氧剝奪誘導

11、細胞內ROS的含量，具有明顯的抗氧化作用。
　　黃芩苷減少糖氧剝奪誘導細胞內ROS的含量，減少對bEnd.3細胞的損害。同時，黃芩苷能維持細胞的生理結構穩(wěn)定，防止細胞質溶解，細胞核碎裂，細胞器腫脹等，減少細胞晚期凋亡和壞死。通過分析本次實驗，可發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對糖氧剝奪誘導bEnd.3細胞的損害的保護作用可能是通過調節(jié)細胞晚期凋亡和壞死的變化來實現(xiàn)的，其中ROS的變化參與其中。但是，細胞的存活需要能量供應，在糖氧剝奪的條件下，細胞能量