反油酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究.pdf

1、反式脂肪酸(trans fatty acid，TFA)是一類存在于加工油脂和含油脂類加工食品中的常見組成成分。目前已經(jīng)有很多關(guān)于TFA和心腦血管疾病關(guān)系的報(bào)道，顯示了TFA與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，但對(duì)于其具體致病的作用機(jī)制尚不明確。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)及其他很多心腦血管疾病發(fā)病的初始環(huán)節(jié)，在AS發(fā)病過程中占有重要地位。內(nèi)皮細(xì)胞周期阻滯以及內(nèi)皮細(xì)胞的不正常凋亡是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要激發(fā)因素，在AS發(fā)

2、生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的推動(dòng)作用。
　　 目前世界上針對(duì)TFA對(duì)AS及其他心腦血管疾病的研究主要聚焦于內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡兩個(gè)方面上，并且研究的大多是反式脂肪酸的混合物，很少有針對(duì)單個(gè)種類的反式脂肪酸對(duì)AS和心腦血管疾病的影響研究。鑒于我國居民日益增多的TFA攝入量以及我國關(guān)于TFA與人體健康研究甚少的現(xiàn)狀，研究TFA對(duì)AS的影響及其作用機(jī)制具有明顯的理論價(jià)值和社會(huì)意義。本課題針對(duì)反油酸研究其與AS及心腦血管疾病的

3、關(guān)系，主要通過反油酸對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞周期及凋亡的影響，來探討反油酸通過p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制，為反式脂肪酸與心腦血管疾病的關(guān)系以及心血管疾病的防治提供重要理論依據(jù)和科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　 本研究通過ELISA法檢測(cè)了反油酸作用前后細(xì)胞培養(yǎng)液中P-選凝素、sICAM-1、TNF-α、ET-1、TXA-2、PGI2等內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙指標(biāo)的變化，確定不同濃度的TFA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的影響;

4、采用流式細(xì)胞儀測(cè)定TFA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響;通過Western-blot檢測(cè)反油酸作用前后內(nèi)皮細(xì)胞中與細(xì)胞周期和凋亡有關(guān)的CDK4和PA28γ的變化;利用RT-PCR檢測(cè)TFA作用前后細(xì)胞中p21、p53、Bcl-2、CDK4、CyclinD1、PA28γ等周期凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的變化，定量檢測(cè)TFA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞周期、凋亡的影響，探討反油酸通過p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。得到的結(jié)果如下:
　　

5、 1.TFA能使細(xì)胞功能障礙的生物學(xué)指標(biāo)P-選凝素、sICAM-1、ET-1、TXA-2及TNF-α的分泌升高，PGI2分泌降低。P-選凝素和sICAM-1的大量分泌會(huì)引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附，致使白細(xì)胞穿出微血管壁，引起局部組織炎癥反應(yīng)，TNF-α分泌升高，易加劇炎癥反應(yīng)，抗炎因子與促炎因子調(diào)節(jié)失衡，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)而造成全身多器官功能障礙。ET-1升高可造成局部微循環(huán)障礙，促進(jìn)血栓形成，加速了炎癥反應(yīng)和AS的進(jìn)程

6、。同時(shí)，ET-1升高可以抑制PGI2的合成和釋放，同時(shí)促進(jìn)TXA-2的分泌，導(dǎo)致PGI2/TXA-2調(diào)節(jié)失衡，增加血管張力的，血液處于高凝狀態(tài)，從而增加了心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生率。各種指標(biāo)表明，TFA能夠造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
　　 2.TFA作用后，HUVEC細(xì)胞凋亡率增加，高濃度的反油酸對(duì)細(xì)胞凋亡影響較大，早期凋亡率和晚期凋亡率均有大幅度提高，低濃度的反油酸也使細(xì)胞凋亡率升高，但影響不大。
　　 3.Western-b

7、lot檢測(cè)結(jié)果顯示，TFA作用后，內(nèi)皮細(xì)胞中CDK4表達(dá)明顯下降，且作用呈劑量依賴性，CDK4下降，使細(xì)胞滯留在G0/G1期，降低S和G2/M期細(xì)胞比例，阻斷了細(xì)胞周期的進(jìn)行，加速細(xì)胞凋亡。PA28γ，表達(dá)下降，減弱了Mdm2對(duì)p53的負(fù)反饋?zhàn)饔茫璧K了p53的降解，使細(xì)胞在G1停滯，DNA損傷無法修復(fù)，使細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，TFA可以導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和加速細(xì)胞凋亡。
　　 4.通過RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)反油酸能夠升高細(xì)胞內(nèi)p2

8、1、p53的mRNA相對(duì)表達(dá)量，降低Bcl-2、CDK4、CyclinD1、PA28γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量，并與反油酸濃度相關(guān)。PA28γ降低，致使P53表達(dá)升高，增強(qiáng)了對(duì)Bcl-2的抑制，降低了Bcl-2抑制凋亡的作用，激活了Caspase9，進(jìn)而激活Caspase3，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。p53表達(dá)升高又增加了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物p21的表達(dá)，使CDK4、CyclinD1下降，減弱了CDK4/CyclinD1對(duì)G1向S期轉(zhuǎn)變的調(diào)控，導(dǎo)致G1期阻滯，使細(xì)

9、胞不能完成正常的有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這說明反油酸即可以通過激活p53，進(jìn)而激活p21，來誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯導(dǎo)致細(xì)胞死亡，又可以通過激活p53，進(jìn)而激活Bcl-2蛋白激活線粒體通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 綜上所述，TFA能夠通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的各類炎癥因子和細(xì)胞因子造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程，并且TFA能夠上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)，通過p53介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞阻滯通路誘