18646.d對(duì)羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)與活性研究

1、D對(duì)羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)與活性研究對(duì)羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)與活性研究OptimizedExpressionoftheRecombinanthpgtGeneEnzymeKiicacteristics學(xué)科專(zhuān)業(yè)：制藥工程研究生：王宗瑞指導(dǎo)教師：趙廣榮教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一二年五月摘要苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（4Hydroxyphenylglycineaminotransferase）是假單胞菌所產(chǎn)生的一種能夠合成D苯甘氨酸的重

2、要轉(zhuǎn)氨酶。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于該酶的研究較少，因此對(duì)于該重組酶體外活性的測(cè)定，研究其主要功能和酶動(dòng)力學(xué)，對(duì)于該酶在工業(yè)上的應(yīng)用有重要的意義。依據(jù)密碼子偏好性，設(shè)計(jì)、優(yōu)化、合成hpgt全長(zhǎng)基因，并成功構(gòu)建了大腸桿菌畢赤酵母穿梭載體pPIC9Khpgt，并將其整合至畢赤酵母GS115的染色體中，以期實(shí)現(xiàn)其分泌表達(dá)。對(duì)整合有hpgt基因的畢赤酵母進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，獲得了重組酶，并測(cè)定轉(zhuǎn)化率及其酶的活性。構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pCDFhpgt，并將其轉(zhuǎn)入感受

3、態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3），通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件獲得可溶性的重組蛋白HisHpgT。利用NiNTA柱純化技術(shù)獲得高純度的HisHpgT融合蛋白，蛋白濃度為0.405mgmL。分別測(cè)定融合蛋白在正反向反應(yīng)中的酶活力單位及最佳的反應(yīng)溫度、pH值及其他動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并對(duì)該酶特性作相關(guān)的機(jī)理分析。測(cè)定結(jié)果表明，正向反應(yīng)和反向反應(yīng)的酶比活力分別為749mUmg、2257mUmg，此酶分解苯甘氨酸的能力要強(qiáng)于合成苯甘氨酸；正向反應(yīng)的最適溫度與p