人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同工酶1單克隆抗體的篩選鑒定及膠體金快速檢測試紙條的制備.pdf

1、目的：
　　丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）被廣泛認(rèn)為是肝損傷和臨床前藥物毒性研究最敏感的標(biāo)志物，臨床主要通過測定其總活性來判斷是否有肝損傷。對ALT的兩種同工酶，ALT1和ALT2的特異性檢測較ALT總活性測定具有更高的診斷價(jià)值。本研究主要通過基因重組技術(shù)獲得ALT1同工酶重組蛋白，并采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備出具有高度特異性和靈敏度的ALT1同工酶單抗，然后通過抗體的配對篩選獲得能夠特異性檢測ALT1的最佳配對單克隆抗體。以篩選出的單抗

2、為基礎(chǔ)，制備出ALT1膠體金免疫層析試紙條，為特異性檢測血清中ALT1蛋白提供了有力的依據(jù)，同時(shí)也有利于初步探討人血清中ALT1分布水平與ALT活性的關(guān)系。
　　方法：
　　利用RT-PCR方法從人肝癌細(xì)胞(HepG2)擴(kuò)增回收完整的ALT1基因，采用基因重組技術(shù)與pET32a(+)質(zhì)粒連接，獲得含有ALT1完整基因的重組質(zhì)粒。并將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET32a(+)-ALT1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，采用鎳

3、柱（Ni2+）親和層析法純化ALT1重組蛋白。用純化后的蛋白免疫Balb/c小鼠，并將經(jīng)過四次免疫后的小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和有限稀釋法進(jìn)行克隆篩選，至挑選出單一并且能夠穩(wěn)定分泌特異性MAb的雜交瘤細(xì)胞株。采用雙抗體夾心ELISA法篩選出一對特異性的單抗，用于制備膠體金免疫層析試紙條。對試紙條的靈敏度和特異性進(jìn)行分析后，檢測不同ALT活性的人血清樣本。
　　結(jié)果：
　　通過原核表

4、達(dá)制備出了ALT1重組蛋白。以純化后的ALT1作為抗原免疫Balb/c小鼠，并且采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，獲得了8株單一且能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。并采用雙抗體夾心ELISA法篩選出BD7和DG3配對的MAb，經(jīng)過驗(yàn)證這對單克隆抗體具有高度的特異性、抗體效價(jià)及親和力。并且根據(jù)篩選出的單克隆抗體BD7和DG3，制備出了具有高度靈敏度和特異性的ALT1膠體金快速檢測試紙條。試紙條能夠檢測的最低ALT1活性為12U/L，且特異性高與其他蛋白沒