α-烯醇化酶單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性的初步鑒定.pdf

1、烯醇化酶是一種普遍存在的細(xì)胞質(zhì)糖酵解酶，它在糖酵解過程中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與2-磷酸甘油酸(PGA)之間的轉(zhuǎn)化。最近的研究表明，烯醇化酶不僅僅只在糖酵解與糖異生過程中發(fā)揮酶的催化作用，它還是一種具有多種不同功能的蛋白質(zhì)。烯醇化酶可作為自身抗原，誘發(fā)機體免疫反應(yīng)，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病;也可作為c-myc啟動子結(jié)合蛋白負(fù)向調(diào)控c-myc表達，參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化過程;可作為纖維蛋白溶酶原受體參與纖溶過程，還可作為特異性標(biāo)志物用

2、于肺癌的診斷等。在各種傳染病及自身免疫病中被檢測到烯醇化酶抗體，這些抗體在病理生理條件下可能促使了某些特定器官的微生物感染及細(xì)胞不可控的增長繁殖。本文旨在研究烯醇化酶單克隆抗體對于烯醇化酶的特異性作用及其抗原表位的預(yù)測分析，從而探討烯醇化酶抗體在人體病理生理活性研究中的潛在價值。
　　本文通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建人α-烯醇化酶基因的重組表達載體，并將成功表達的人α-烯醇化酶純化后作為抗原免疫小鼠，用以制備烯醇化酶單克隆抗體。經(jīng)過細(xì)胞融

3、合，有限稀釋，陽性克隆檢測以及克隆化培養(yǎng)后，成功篩選出一株單克隆抗體6B2，同時應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和免疫組化技術(shù)對此抗體加以驗證。噬菌體隨機十二肽展示技術(shù)篩選6B2單克隆抗體的抗原表位，并應(yīng)用Ellipro、 PyMOL等生物學(xué)軟件分析預(yù)測其抗原表位。研究結(jié)果如下:
　　1.通過PCR擴增得到人α-烯醇化酶目的基因，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28a-eno，經(jīng)過單雙酶切驗證后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達。經(jīng)過SDS-PAG

4、E分析，在37℃，0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達6h條件下，烯醇化酶的表達量最大。超聲破碎，所得上清及沉淀經(jīng)過SDS-PAGE分析，烯醇化酶在細(xì)胞上清液中有很高的可溶性表達。
　　2.將入α-烯醇化酶與本實驗室之前制備大腸桿菌烯醇化酶作為抗原免疫小鼠，四次免疫后血清效價稀釋一百倍時OD值達到1.5，可用于細(xì)胞融合。通過細(xì)胞融合成功制備一株抗入α-烯醇化酶單克隆抗體命名為6B2，生物學(xué)特性檢測顯示屬于IgG1亞型，能夠與人α-烯醇化酶

5、和大腸桿菌烯醇化酶發(fā)生特異性反應(yīng)，與人α-烯醇化酶的特異性反應(yīng)強于大腸桿菌烯醇化酶。
　　3.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、免疫組化技術(shù)驗證單克隆抗體6B2與組織細(xì)胞內(nèi)的α-烯醇化酶的反應(yīng)。由于烯醇化酶在進化上高度保守，所以取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞做細(xì)胞爬片，人α-烯醇化酶抗體6B2作為一抗，驗證單克隆抗體與組織細(xì)胞內(nèi)的烯醇化酶的結(jié)合情況。實驗結(jié)果表明，此單抗6B2能結(jié)合巨噬細(xì)胞的烯醇化酶。
　　4.應(yīng)用噬菌體隨機十二肽展示庫篩選6B2單克隆

6、抗體的抗原表位，經(jīng)過三輪的擴增與淘選后，提取特異性結(jié)合的噬菌體DNA，測序分析。測序結(jié)果顯示插入的相同序列為CGCACTGCCCAGTAGACCTGAGAACTTCAGTTCCAG，相對應(yīng)的氨基酸序列DLDFKSPDDPSR，此序列與人α-烯醇化酶的259-262及267-269的氨基酸相同。經(jīng)過Ellipro、PDB等生物學(xué)軟件預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)所測得的氨基酸序列恰好位于烯醇化酶三維結(jié)構(gòu)中的兩個凸環(huán)上，分別為第259-262氨基酸與第26