α-烯醇化酶單克隆抗體的制備及生物學特性的初步鑒定.pdf

1、烯醇化酶是一種普遍存在的細胞質糖酵解酶，它在糖酵解過程中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與2-磷酸甘油酸(PGA)之間的轉化。最近的研究表明，烯醇化酶不僅僅只在糖酵解與糖異生過程中發(fā)揮酶的催化作用，它還是一種具有多種不同功能的蛋白質。烯醇化酶可作為自身抗原，誘發(fā)機體免疫反應，參與類風濕關節(jié)炎發(fā)病;也可作為c-myc啟動子結合蛋白負向調控c-myc表達，參與調控細胞生長、分化過程;可作為纖維蛋白溶酶原受體參與纖溶過程，還可作為特異性標志物用

2、于肺癌的診斷等。在各種傳染病及自身免疫病中被檢測到烯醇化酶抗體，這些抗體在病理生理條件下可能促使了某些特定器官的微生物感染及細胞不可控的增長繁殖。本文旨在研究烯醇化酶單克隆抗體對于烯醇化酶的特異性作用及其抗原表位的預測分析，從而探討烯醇化酶抗體在人體病理生理活性研究中的潛在價值。
　　本文通過分子克隆技術構建人α-烯醇化酶基因的重組表達載體，并將成功表達的人α-烯醇化酶純化后作為抗原免疫小鼠，用以制備烯醇化酶單克隆抗體。經過細胞融

3、合，有限稀釋，陽性克隆檢測以及克隆化培養(yǎng)后，成功篩選出一株單克隆抗體6B2，同時應用免疫熒光技術和免疫組化技術對此抗體加以驗證。噬菌體隨機十二肽展示技術篩選6B2單克隆抗體的抗原表位，并應用Ellipro、 PyMOL等生物學軟件分析預測其抗原表位。研究結果如下:
　　1.通過PCR擴增得到人α-烯醇化酶目的基因，構建重組表達質粒pET28a-eno，經過單雙酶切驗證后，轉入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達。經過SDS-PAG

4、E分析，在37℃，0.5mM IPTG誘導表達6h條件下，烯醇化酶的表達量最大。超聲破碎，所得上清及沉淀經過SDS-PAGE分析，烯醇化酶在細胞上清液中有很高的可溶性表達。
　　2.將入α-烯醇化酶與本實驗室之前制備大腸桿菌烯醇化酶作為抗原免疫小鼠，四次免疫后血清效價稀釋一百倍時OD值達到1.5，可用于細胞融合。通過細胞融合成功制備一株抗入α-烯醇化酶單克隆抗體命名為6B2，生物學特性檢測顯示屬于IgG1亞型，能夠與人α-烯醇化酶

5、和大腸桿菌烯醇化酶發(fā)生特異性反應，與人α-烯醇化酶的特異性反應強于大腸桿菌烯醇化酶。
　　3.應用免疫熒光技術、免疫組化技術驗證單克隆抗體6B2與組織細胞內的α-烯醇化酶的反應。由于烯醇化酶在進化上高度保守，所以取小鼠腹腔巨噬細胞做細胞爬片，人α-烯醇化酶抗體6B2作為一抗，驗證單克隆抗體與組織細胞內的烯醇化酶的結合情況。實驗結果表明，此單抗6B2能結合巨噬細胞的烯醇化酶。
　　4.應用噬菌體隨機十二肽展示庫篩選6B2單克隆

6、抗體的抗原表位，經過三輪的擴增與淘選后，提取特異性結合的噬菌體DNA，測序分析。測序結果顯示插入的相同序列為CGCACTGCCCAGTAGACCTGAGAACTTCAGTTCCAG，相對應的氨基酸序列DLDFKSPDDPSR，此序列與人α-烯醇化酶的259-262及267-269的氨基酸相同。經過Ellipro、PDB等生物學軟件預測分析，發(fā)現(xiàn)所測得的氨基酸序列恰好位于烯醇化酶三維結構中的兩個凸環(huán)上，分別為第259-262氨基酸與第26