人胎盤絨毛層間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的優(yōu)化及生物學(xué)特性的初步分析.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化能力的干細(xì)胞，有著良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。以往研究主要集中在入骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，但由于人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得需要通過骨髓穿刺，而且其數(shù)量隨年齡的增長而急劇下降，限制了人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用。因此，越來越多的研究者開始尋找間充質(zhì)干細(xì)胞的其他來源，例如外周血、臍帶血、臍帶、乳牙以及胎盤。胎盤作為孕婦妊娠后的廢棄物，易于獲得且對其研究

2、和應(yīng)用無倫理道德的爭論，成為間充質(zhì)干細(xì)胞來源的新的研究熱點(diǎn)。2007年人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞研究國際會議對人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用潛能給予了充分肯定。但是MSCs在胎盤組織中的分布以及如何有效地在體外獲得和擴(kuò)增是亟待解決的問題。 為此，本研究采用常規(guī)方法獲取人胎盤絨毛層間充質(zhì)干細(xì)胞(Human placentachorion derived MSCs，hCMSCs)，在此基礎(chǔ)上，對hCMSCs體外擴(kuò)增的條件及生物學(xué)特性作初步

3、分析，從而為實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用快速有效提供種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 第一部分hCMSCs的組織定位及體外分離培養(yǎng)與鑒定 目的：確定hCMSCs的組織定位，從胎盤絨毛層組織體外分離培養(yǎng)hCMSCs，在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，為體外優(yōu)化培養(yǎng)hCMSCs提供實(shí)驗(yàn)參數(shù)。方法：采用免疫組織化學(xué)染色確定hCMSCs在胎盤絨毛層中的組織定位；選擇性剪取胎盤絨毛層組織，經(jīng)IV型膠原酶消化、貼壁和傳代培養(yǎng)獲得hCMSCs；流

4、式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測其表面標(biāo)志；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；采用多種誘導(dǎo)條件分別將其向脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)以觀察細(xì)胞的分化潛能。結(jié)果：(1)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，胎盤絨毛層中軸血管周圍富有CD105、CD90陽性的間充質(zhì)干細(xì)胞；(2)采用機(jī)械分離和IV型膠原酶消化法體外分離培養(yǎng)能有效獲得hCMSCs；(3)倒置顯微鏡觀察hCMSCs呈典型的成纖維樣貼壁生長，流式細(xì)胞儀分析顯示，hCMSCs高表達(dá)

5、CD73、CD90和CD105，不表達(dá)CD14、CD34、CD45和HLA-DR.；(4)hCMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)細(xì)胞呈神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，NSE免疫熒光染色呈陽性；(5)hCMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后，胞內(nèi)有明顯的脂滴出現(xiàn)，油紅染色呈陽性。結(jié)論：從人胎盤絨毛層組織富集hCMSCs，經(jīng)機(jī)械分離和酶消化法結(jié)合，能有效地獲得hCMSCs，流式細(xì)胞術(shù)及誘導(dǎo)分化結(jié)果提示獲得的hCMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志及誘導(dǎo)分化能力，可以成為體外

6、優(yōu)化培養(yǎng)的種子細(xì)胞。 第二部分細(xì)胞因子對hCMSCs體外促增殖作用及其生物學(xué)特性的影響 目的：優(yōu)化hCMSCs的體外培養(yǎng)條件，并對優(yōu)化培養(yǎng)條件培養(yǎng)的hCMSCs生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析，為實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用快速有效地提供種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。方法：選擇性剪取人胎盤絨毛層組織，通過0.1％Ⅳ型膠原酶消化，按常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)兩代后用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，MTT法檢測下列不同濃度不同細(xì)胞因子：人白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，

7、IL-6)、激發(fā)型鼠抗人IL-6信號傳導(dǎo)鏈GP130(glycoprotein130，GP130)、人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulating factor，M-CSF)、人干細(xì)胞生長因子(stem cell factor，SCF)、人Flt3配體(flt3 ligand，F(xiàn)L)、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)對hCMSCs的增殖作用

8、；光學(xué)顯微鏡觀察優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的hCMSCs的細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的hCMSCs的細(xì)胞表型；油紅染色及免疫熒光分別鑒定優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的hCMSCs向脂肪細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的潛能；RT-PCR分析FL的受體flt3的基因表達(dá)。結(jié)果：(1)MTT法檢測及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，比較不同濃度的不同細(xì)胞因子對hCMSCs體外增殖作用的影響，含bFGF、FL的培養(yǎng)條件均能有效地促進(jìn)細(xì)胞的體外增殖，而FL的促增殖作用

9、更強(qiáng)；(2)光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)含bFGF、FL的培養(yǎng)條件培養(yǎng)的細(xì)胞呈典型的成纖維樣貼壁生長；(3)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示含bFGF、FL的培養(yǎng)條件培養(yǎng)的hCMSCs高表達(dá)CD73、CD90、CDl05，不表達(dá)CD14、CD34、CD45和HLA-DR；(4)含bFGF、FL的培養(yǎng)條件培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后NSE免疫熒光染色呈陽性；向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后有脂滴的出現(xiàn)；(5)RT-PCR結(jié)果顯示hCMSCs表達(dá)flt3的mRNA。結(jié)論

10、：諸多生物因子中bFGF和FL具有較強(qiáng)的促hCMSCs體外增殖作用而FL作用更為明顯，同時(shí)其能保持hCMSCs的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型及多向分化潛能，因此FL可以作為體外培養(yǎng)hCMSCs的良好生長因子。 本研究明確了人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞在胎盤絨毛層的組織定位，建立了有效分離、體外擴(kuò)增hCMSCs的實(shí)驗(yàn)體系，在此基礎(chǔ)上，證明了FL具有有效地促hCMSCs體外增殖的作用，而且hCMSCs表達(dá)FL的受體flt3，為下一步研究FL對hCMS